2019 Fiscal Year Research-status Report
間葉系幹細胞の酸素濃度変化に着目した変形性膝関節症の病態解明
| Project/Area Number |
18K16631
|
|---|
| Research Institution | Nara Medical University |
|---|
Principal Investigator |
稲垣 有佐 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (60707529)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 変形性膝関節症 / 間葉系幹細胞 / iPS細胞 / 骨分化 / 酸素濃度 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
変形性膝関節症の組織学的特徴として、骨代謝亢進の結果、骨硬化・骨棘といった過剰な骨形成があげられ、多くの報告がされてきたが、その詳細な機序はまだまだ不明な点がある。研究代表者らは低酸素環境にて培養されたのラット骨髄間葉系幹細胞が通常酸素環境に暴露されるとその骨形成能が大きく促進されることを報告した。
本研究の目的は、ヒト幹細胞を用いて、低酸素環境から通常酸素環境への変化時のHypoxia inducible factors: HIFs等を中心とした分子レベルの機序を通して変形性膝関節症の病態解明をおこなうことである。当初、本研究に使用する細胞として、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞を予定していたが、昨今の急速なiPS細胞研究の基盤整備を鑑み、実験対象細胞をiPS細胞に変更した。
過去のES細胞骨分化誘導に関する文献をもとにiPS細胞骨分化誘導実験を行った。骨分化誘導を行わない群をコントロール群とし、骨分化の評価を形態観察、Alkaline Phosphatase: ALP染色、遺伝子発現等で行った。形態観察において、骨分化誘導群では細胞外基質の産生・ハイドロキシアパタイトの沈着を認め、ALP染色陽性であった。また骨分化関連遺伝子の発現亢進を認めた。
本研究において、適切な骨分化誘導培養を行うことにより、通常酸素環境でヒトiPS細胞よりの骨形成が確認できた。また、幹細胞性および骨分化に関する遺伝子発現評価にあたりQuantitative polymerase chain reaction: qPCRのインターナルコントロール遺伝子設定が重要であり、各候補遺伝子から解析ソフトにて、本実験系における最適な遺伝子を決定し、論文投稿準備中である。上記結果をもとに酸素環境を調節し、ヒトiPS細胞骨分化能に対する酸素濃度の検証を開始している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
申請時、変形性膝関節症の病態解明をめざす本研究に使用する細胞として、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞を予定していたが、その増殖能から効率的な実験遂行を、また充実したリソースから実験対象細胞をiPS細胞に変更した。
ヒトiPS細胞を過去の文献をもとに通常酸素環境下で骨分化誘導実験を行った。骨分化の評価を形態観察、アルカリフォスファターゼ染色、遺伝子発現等で行った。形態観察において、骨分化誘導群では細胞外基質の産生・ハイドロキシアパタイトの沈着を認め、アルカリフォスファターゼ染色陽性であった。骨分化関連の遺伝子発現解析において、当初十分な量と質のリボ核酸の抽出ができず、骨分化培養の反復や、リボ核酸抽出条件を検討などを必要したが、本実験系における最適なインターナルコントロール遺伝子を決定し、論文投稿準備中である。
次にiPS細胞を低酸素環境に馴化のうえ、骨分化誘導する実験にすすんだが、急激な酸素濃度の変化は細胞のアポトーシスを誘発し、培養続行が困難であった。現在酸素濃度を漸減するなどの方法で、培養継続が可能となっている。
上記経過により、進捗状況は遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究において、適切な骨分化誘導培養を行うことにより、通常酸素環境でヒトiPS細胞よりの骨形成が確認できた。さらに本実験系における最適なインターナルコントロール遺伝子の決定も行った。低酸素培養器を使用し、酸素環境を調節し、ヒトiPS細胞骨分化能に対する酸素濃度の影響を、幹細胞性、骨分化および酸素環境応答関連遺伝子発現を通して、解析していく予定である。さらに選定した骨分化および酸素環境応答関連遺伝子をCRISPR-Cas9系などで遺伝子発現制御し、上記実験系にて骨分化にどのように影響を与えるかを検討する。また人工膝関節置換術時に同意の上採取した軟骨下骨組織を組織学的評価のうえ、上記、in vitro実験系にて選定した分子について免疫組織学的染色を行ない、変形性膝関節症の病態に関与しているかを検討していく予定である。
本年度、基盤Cで本研究の発展課題を採択いただき、上記研究を継続的に実施していくことが可能となった。
|
| Causes of Carryover |
iPS細胞骨分化における、遺伝子発現の解析、低酸素環境への馴化などが当初より時間を要し、計画に遅れが生じており、計画延長を申請し、認めていただいた。今後、低酸素培養器を使用し、酸素環境を調節し、ヒトiPS細胞骨分化能に対する酸素濃度の影響を、幹細胞性、骨分化および酸素環境応答関連遺伝子発現を通して、解析していく予定である。さらに選定した骨分化および酸素環境応答関連遺伝子をCRISPR-Cas9系などで遺伝子発現制御し、上記実験系にて骨分化にどのように影響を与えるかを検討する。また人工膝関節置換術時に同意の上採取した軟骨下骨組織を組織学的評価のうえ、上記、in vitro実験系にて選定した分子について免疫組織学的染色を行ない、変形性膝関節症の病態に関与しているかを検討していく予定である。
|
