腎癌血中遊離DNA断片の短小化のメカニズム解明とその遺伝子変異の検出方法の確立

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16692
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 山本 致之 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (90759557)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 循環腫瘍DNA

Outline of Annual Research Achievements

腎細胞癌の病理組織像の種類は複数あるため、本研究は腎細胞癌の遺伝子変異に着目した研究であり、集団を均一にする目的で、最も高頻度の淡明細胞型腎細胞癌(ccRCC)に絞って研究を開始した。腎細胞癌患者の治療前の血漿からQIAamp circulating nucleic acid kit(QIAGEN社)を用いて、cell-free DNA(cfDNA)を抽出した。cfDNAの存在は、蛍光光度計、定量的リアルタイムPCR法ならびにマイクロチップ型電気泳動装置にて確認した。続いて、腎細胞癌特異的な循環腫瘍DNA(ctDNA)をターゲットシークエンスで検出するために、公共データベースの約2万種類の遺伝子の中から、変異頻度や腎細胞癌発生・増殖のpathwayへの関連、分子標的治療薬の標的遺伝子を考慮して、標的遺伝子を48個に絞り込み、腎癌カスタムパネルを作成した。シークエンスは、癌細胞由来ゲノムDNA、リンパ球由来ゲノムDNA、cfDNAを次世代シークエンサーにて比較解析を行い、患者固有の腎細胞癌特異的遺伝子変異を同定し、ctDNAを同定する方針とした。次世代シークエンサーはHiSeq2500を使用した。解析は東大のスーパーコンピューターにインターネット接続して行い、解析pipelineはGenomon2を使用した。5例でシークエンスを行い、全例癌ゲノムで変異を検出した。また5例中2例でcfDNA中に変異を認め、ctDNAが存在することが分かった。またcfDNA中に変異を同定した症例では、デジタルPCRを用いて、変異の確認を行い、同一の変異が検出・確認できれば、シークエンスの結果が正しかったことが示せると考えた。現在必要に応じてデジタルPCRのプライマー・プローブを設計中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

循環腫瘍DNAのシークエンス解析を調整していることと、デジタルPCRのプライマー・プローブ選定に時間を要しているためである。

Strategy for Future Research Activity

今後は、腎細胞癌における循環腫瘍DNAを解析・同定することと並行して、シークエンスによるctDNAの断片長解析も行う。

Causes of Carryover

シークエンス解析を次年度に繰り越すため。