2018 Fiscal Year Research-status Report

Molecular characterization of carcinoma arising in mature cystic teratoma of the ovary

Research Project

Project/Area Number	18K16760
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	田村亮新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (70650620)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	融合遺伝子 / TP53 / PIK3CA / FGFR3-TACC3 / TACSTD2-OMA1 / UPK3B-PMS2
Outline of Annual Research Achievements	卵巣成熟嚢胞性奇形腫から発生した扁平上皮癌5例の凍結検体に対して、一部を切片化して癌組織が十分に含有されていることを確認した後、全エクソンシークエンスおよびRNAシークエンスを実施した。さらに、質が高いホルマリン固定検体3例に対して、CancerPlexを用いて、435遺伝子を対象としたターゲットシーケンスを実施した。全エクソンシーケンスの解析の結果、TP53およびPIK3CAの非同義変異を5例中4例で認め、この癌種における共通の特徴と思われた。その他、PI3K-AKT-mTOR pathwayやCell cycleに関与する遺伝子に、高頻度に遺伝子異常を認めた。また、RNAシーケンスデータを、独自に開発した融合遺伝子を同定するpipelineであるPRADA、および融合遺伝子の検出力が良好とされるFusionCatcherの２つpipelineを用いて解析を行なった。その結果、複数の癌種で同定されドライバー遺伝子と考えられているFGFR3-TACC3融合遺伝子を1例で認めた。さらに、5例中2例でTACSTD2-OMA1およびUPK3B-PMS2融合遺伝子を認め、これらの融合遺伝子が、この癌種に共通の特徴として、癌の発生・進展に関与している可能性があると考えられた。来年度以降は、症例を追加すると共に、同定した融合遺伝子および癌遺伝子の頻度の確認や機能解析を進めていく方針である。また、正常組織からの悪性転化メカニズム解明のために、悪性転化症例の発生母地となっている組織の病理学的検討やLaser Microdissectionを用いたDNA、RNAの抽出について条件を検討しており、順次進めていく方針である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度に、卵巣成熟嚢胞性奇形種悪性転化症例に対して、全エクソンシーケンス、RNAシークエンス解析およびターゲットシーケンスを実施し、本疾患ににおける癌遺伝子変異や、融合遺伝子プロファイルを明らかにしており、解析は順調に進んでいる。稀な疾患であること、検体のサンプリング自体が難しく、切片化した後に癌の含有量が少なく、解析を行えない検体が複数あることも判明し、検体収集に関してはやや遅れている。また悪性転化のメカニズムの検証に向け、癌症例それぞれの発生母地の検討、および同定した異常の意義を検証するための実験計画を詳細に検討している。おおむね計画通りに進行しており、予定している実験を完遂できると思われる。
Strategy for Future Research Activity	来年度は、予定通り卵巣成熟嚢胞性奇形腫悪性転化症例の、ホルマリン固定検体に対して、病理学的に検証した発生母地となる正常組織も含めて、Laser Microdissectionを用いたDNA、RNAの抽出を行いたいと考えている。続いて、抽出したDNA、RNAに対して、PCR、サンガーシーケンスを用いて遺伝子異常・融合遺伝子の頻度の確認を行う。さらに、Western blot法や免疫染色を用いて、同定した遺伝子異常の蛋白レベルでの発現を評価する。また、同定した遺伝子異常、融合遺伝子の機能を解析するために、発生母地として使用する正常細胞株を選定し、クローニングおよび遺伝子導入の準備を進める方針である。
Causes of Carryover	報告書に記載したように、希少疾患を対象としているため、追加の検体採取が順調に進まなかった。そのため、初年度に予定していた全エクソンシーケンスやRNAシーケンスが進んでおらず、想定した額と差額が生じている。検体採取は適宜継続しているため、検体数がある程度まとまり次第追加でシーケンスを行う予定となっている。また、元々予定していたPCR、サンガーシーケンス、Western blot、免疫染色、細胞実験に関しては順調に進行しており、来年度予定通り行う方針としている。