2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞を用いた遺伝性進行性難聴DFNA５の病態解析と創薬スクリーニング
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18K16856
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
細谷 誠 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (30645445)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 疾患iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018年度に、研究計画に基づいて正常iPS細胞にCRISPR/Cas9を用いてDFNA5疾患特異的iPS細胞を樹立した。これら疾患iPS細胞からDFNA5陽性細胞が誘導可能であるかを検討し、実際に誘導が可能であることを2018年度に確認している。また、正常細胞におけるDFNA5の発現の変化をRNAレベルおよびタンパクレベルで解析し、細胞ストレスに対する応答によりこれらの発現量および分子量が変化するかを検討し、ストレス負荷時に発現量が変化すると同時に、合成されたDFNA5タンパクの切断により分子量の変化を生じることを確認していた。
2019年度は、本現象が疾患ラインで生じるか、また、正常細胞由来内耳細胞と比較して特異的な反応を来すかどうかを検討した。さらに、生じるとしたらその変化が仮説通りに細胞死を誘導するかどうかを検討した。
今回の我々の検討では、疾患iPS細胞由来内耳細胞においても正常細胞と同様に特定の細胞ストレスに反応し、DFNA5遺伝子の発現量の増加が生じることが分かった。また、正常細胞と同様に合成されたDFNA5タンパクの切断により分子量の異なる産物が生じることが分かった。DFNA5の遺伝子異常に伴う難聴の原因は、これまで、変異遺伝子から生じるタンパクは遺伝子変異によりGain of Functionの結果、細胞毒性を生じると考えられていた。今回、我々の検討では、変異DFNA5の発現量を増加させることはできたが、実際に細胞死を誘導するかどうかは明らかにできなかった。今後、更なる検討を追加し、異常遺伝子の発現量の増加が仮説通りに細胞死を誘導するかどうかをより詳細に検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験自体は予定通り進捗しているが、想定していた仮説と一部異なる結果が得られたため、追加の検討が必要となった。
今後、疾患特異的iPS細胞由来内耳細胞から誘導される異常DFNA5の分子生物学的な特徴の更なる解析を行う。さらに、これまでの仮説と異なる結果が得られたことをうけて、正常細胞由来内耳細胞においても、DFNA5の細胞内における役割を再検討する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
疾患特異的iPS細胞由来内耳細胞から誘導される異常DFNA5の分子生物学的な特徴の更なる解析を行う。具体的には、上述のとおりストレス反応に応じて、切断されて生じたと考えられる低分子量のDFNA5タンパクが生じるが、本タンパクが、正常iPS細胞由来内耳細胞と変異iPS細胞由来内耳細胞の間で、分子生物学的挙動が異なるかを検討する。具体的な方法は、ストレス負荷時に正常細胞と変異細胞の間で、低分子型のDNFA5の発現量に差異が生じるか、また、細胞生存率などに影響を及ぼすかを検討する。
さらに、これまでの仮説と異なる結果が得られたことをうけて、正常細胞由来内耳細胞においても、DFNA5の細胞内における役割を再検討する必要がある。本遺伝子においては、細胞死の誘導に関与することが示唆されたデータが存在するが、これまでの我々の検討で診られた特定のストレス負荷時の分子量の変化がどのような変化を細胞レベルで生じるかを検討する。
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| Causes of Carryover |
実験自体は予定通り進捗しているが、想定していた仮説と一部異なる結果が得られたため、追加の検討が必要となった。
今後、疾患特異的iPS細胞由来内耳細胞から誘導される異常DFNA5の分子生物学的な特徴の更なる解析を行う。さらに、これまでの仮説と異なる結果が得られたことをうけて、正常細胞由来内耳細胞においても、DFNA5の細胞内における役割を再検討する。
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