収束イオンビーム走査型電子顕微鏡による外有毛細胞損傷における初期構造変化の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16857
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 安齋 崇 順天堂大学, 医学部, 助教 (20624852)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 外有毛細胞 / 収束イオンビーム搭載走査型電子顕微鏡 / 内耳 / 難聴

Outline of Annual Research Achievements

遺伝性難聴をはじめ、加齢性難聴、騒音性難聴などの感音性難聴は外有毛細胞へのストレス負荷から外有毛細胞の不可逆的な変性をきたす。しかしながら病態における初期の外有毛細胞の機能障害の解剖学的生理学的な解明は進んでいない。
本年度は従来２次元でしかとらえられていなかった、外有毛細胞の超微細構造を、収束イオンビーム搭載走査型電子顕微鏡（FIB/SEM）を用いて得られた連続断面画像をもとに３次元構築することによる可視化することを試みた。
具体的にはC57BL/6J系マウス約3週齢を用いて、聴性脳幹反応(ABR)を測定し、聴力が正常であることを確認したマウスを正常蝸牛モデルとして使用した。
マウスから取り出した蝸牛をエポン樹脂に包埋したブロックから蝸牛感覚上皮の水平断を作成し、収束イオンビーム搭載走査型電子顕微鏡（FIB/SEM）を用いて外有毛細胞を20nm間隔のFIBによる断面加工を行い、走査型電顕(SEM)を繰り返すことにより外有毛細胞全体の連続画像（約400枚、計8μm厚）を得た。
これらのSEMの連続画像からsubsurface cisternaeや細胞膜のデジタル描写によるトレース画像を作成。画像処理ソフトであるAmiraによりグラフィック化し、細胞全体のCSの立体構築及び細胞膜も同様に立体構築し細胞側壁構造全体を立体的に可視化することを試みた。
現在はsubsurface cisternaeの立体構造の構築は実現できたが、今後画像データの精度を上げる事と、画像を数値化すること、また病理モデルマウスと比較する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

FIB/SEMにより外有毛細胞の立体構築及び細胞膜も同様に立体構築し細胞側壁構造全体を可視化することを試みている。その過程においてsubsurface cisternaeについて立体構築に成功している。しかし施設移転に伴い、当初予定していたよりも検体作成が進まず、安定した結果が得られていないため。

Strategy for Future Research Activity

現在は外有毛細胞のsubsurface cisternaeの立体構造の構築は実現できた。今後は画像データの精度を上げる事、細胞内の他の器官についても立体構築を行っていく予定である。そのために現在より多くの検体を定期的に作成し、最適な方法を検証する。
最終的には画像を数値化し、病態モデルマウスと比較し新たな外有毛細胞への障害の指標を作成することを目的としている。

Causes of Carryover

施設移転のため、FIB/SEMに用するための検体作成が本来予定していた数より進まず、経費の余剰が生じた。遺今後は新施設で検体作成を加速させ、関連する消耗品の購入に使用する予定である。