Exploring the mechanisms of carcinogenesis through the aberrant alternative splicing in head and neck cancer

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16860
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 酒井 昭博 東海大学, 医学部, 准教授 (20384886)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 選択的スプライシング / CPSF1 / RNA-Seq / 頭頸部癌 / 扁平上皮癌

Outline of Annual Research Achievements

近年、遺伝子変異以外の発癌機構として遺伝子発現の下流である転写後調節レべルの選択的スプライシングによる発癌機構が明らかになってきており、このスプライシングによる発癌機構が頭頸部癌の発癌に重要な役割を果たしている可能性が十分ある。本研究の目的は頭頸部癌における選択的スプライシングを介した発癌機構を次世代シーケンサー解析を用いて解明し、新しい治療標的となりうるかどうか検討することである。昨年度までの結果で、CPSF1が頭頚部癌に対して発癌に関与していることが示唆された。 そのため、CPSF1遺伝子強制発現・誘導ノックダウン安定細胞株の作成しそれぞれのphenotypeを細胞増殖試験、細胞浸潤試験、コロニー形成試験、アポトーシス試験を用いて検討した。その結果、誘導ノックダウン安定細胞株ではDOX刺激により、細胞増殖が抑制された。また細胞浸潤試験、コロニー形成試験では浸潤、コロニー形成が抑制され、アポトーシス試験ではアポトーシスが更新するという結果であった。遺伝子強制発現株では 細胞増殖が更新するという結果であった。 以上よりCPSF1が発癌を促進する結果が得られたため、それぞれの細胞株よりRNAを抽出し、RNAシーケンス解析を行っ た。Rを用いた独自の解析パイプラインを用いて、変動スプライシング変異の検出を行った。 その結果、CPSF1の遺伝子変異は幅広く癌関連遺伝子のスプライシング変異を誘発するという結果であった。またSingle sample Gene Set Enrichment Analysis を行いパスウエイの検討も行ったが、CPSF1は多くの癌関連のgene setを変化させていることがわかった。
今までの研究で、CPSF1を含むスプライシング遺伝子の発現変化は異常なスプライシング変異発現を誘発することにより、発がんに貢献する可能性があることが わかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

コロナ感染症に伴う臨床業務の激増によりやや遅れが生じたが、延長申請を行い、当初予定していた研究予定通り、順調にすすんでいる。

Strategy for Future Research Activity

次年度は遅れた部分の追加検証を行う。
・細胞株を用いた実験との比較検証:細胞株より得られたスプライシング変異が臨床検体から得られたデーターと重複するかどうか、解析を行う。もし細胞株、 TCGAデータ、臨床検体から共通に得られたスプライシング変異が検出できた場合、それがキーとなるスプライシング変異の可能性あり、それを用いて次のステッ プを行う。
・臨床検体を用いた実験的検証:臨床検体よりRNAを抽出し、cDNAを作成。スプライシング変異を同定可能なprimer、probeを設計し、それらを用いてqRT-PCRに よりスプライシング変異の実験的検証を行う。
・臨床病理学的解析:CPSF1過剰発現と、(1) 腫瘍径、分化度、組織亜型、脈管侵襲など 病理組織学的因子、(2) 術後経過、再発の有無、 (3) 治療感受性、副作用発症の有無などとの関連を解析する。

Causes of Carryover

コロナ感染症の世界的流行による臨床業務の増加にともない、学会発表、論文費用が生じなかった。次年度は、それらの費用や追加実験物品購入に当てる予定である。