咽頭上皮におけるEBウイルスによるオートファジー誘導の生物学的意義の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16878
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 石川 和也 金沢大学, 医学系, 助教 (60623650)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: オートファジー

Outline of Annual Research Achievements

2018年度はすでに当教室にある、リンパ球でのEBV潜伏感染モデル細胞としてGFP遺伝子が組み込まれたB95-8EBV株を用い、pCMV-BZLF1、pRL-BALF4をトランスフェクションすることで溶解感染状態とし、培養液中に放出された組換えEBVを収集し、これをCD21を導入した正常上皮細胞に添加し感染させることで上咽頭癌と同様の上皮細胞におけるEBV感染モデル細胞を作成中である。
上記の細胞作成と並行して、B95-8EBV株におけるオートファジーの評価も並行して行った。オートファジー阻害作用を持つクロロキンとオートファジー活性作用を持つイベルメクチンを添加し、LC3-I、LC3-IIをウエスタンブロットで評価し、クロロキンはオートファジーを阻害し、イベルメクチンはオートファジーを活性化していることが確認できた。またクロロキンでオートファジーを阻害した群では細胞の生存数が有意に低下することが確認できた。
上記の結果より、オートファジーを阻害することが潜伏感染から溶解感染のトリガーとなる可能性を考え、オートファジー活性の変化が潜伏感染のウイルス遺伝子産物におよぼす影響をウエスタンブロットやRT-qPCRを用いて検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CD21を293細胞に導入する実験系で良好な結果が出せず、咽頭上皮でのEBVによるオートファジー誘導について検討ができておらず、先行的に行なっているリンパ球でのEBVによるオートファジー誘導についての検討にとどまっている。
上皮におけるEBV初感染モデル細胞の作成が完了すれば、リンパ球でのEBV感染モデル細胞と同様のプロトコールを用い、上皮でのEBV感染モデル細胞でも実験を行なっていく。

Strategy for Future Research Activity

CD21を293細胞へ導入し、上皮細胞におけるEBV初感染モデル細胞を完成させる。同モデル細胞に対してオートファジーを誘導・阻害し、潜伏感染のウイルス遺伝子産物をウエスタンブロットやRT-qPCRを用いて検討することでオートファジーが潜伏感染におよぼす影響を検討していく予定である。また、作成した同モデル細胞を免疫不全マウスに接種させ、発癌、リンパ増殖性疾患や日和見リン パ腫を発症するかを観察し、EBV関連腫瘍の発生が確認できればクロロキンやイベルメクチンを投与することで、腫瘍のコントロールができるかどうかを検討する。
上皮細胞におけるEBV初感染モデル細胞の作成が困難な場合は、当初の予定であった咽頭上皮におけるEBVによるオートファジー誘導の意義を検討することを変更し、現在先行的に行なっているリンパ球でのEBV感染モデル細胞を用いた実験系にすることも選択肢の一つと考えている。

Causes of Carryover

細胞培養の試薬、ウエスタンブロットやRT-qPCRに必要な試薬、データを解析するためのパソコン、マウスに細胞を植えつけるためのライトなどを購入し、情報収集のための学会参加の旅費として使用した。予想していた金額とほぼ同等の金額であり、今後も予定通り実験を行なっていく。