2019 Fiscal Year Research-status Report
In vitro studies on the action mechanism of grafted nasal mucosal cell sheet
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18K16907
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
葛西 善行 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (60813889)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞シート / 中耳再生治療 / 作用機序の解明 / in vitro実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞シート接着後の作用機序解明を目指し、基礎的に多くの解析ができるin vitro実験からアプローチしている。細胞シートを作製する培地は、上皮細胞の培養に広く使われているKeratinocyte culture medium（KCM）を用いているが、細胞シートの枚数や性質が安定していなかった。そこで、まずは必要な枚数を安定して作製できる条件を探索した。
まず鼻腔粘膜組織をエクスプラント培養して細胞数を確保するが、従来のKCMで得られる細胞数は平均で細胞シート約5枚分程度しか得られず、経時的な変化や条件ごとの詳細な解析をすすめる上で不十分であった。そこでRho kinase inhibitor (ROCKi)を添加すると、平均で細胞シート約20枚分の細胞数が確保され、十分量の細胞数が確保することができた。
得られた細胞は、温度応答性培養皿上に播種してシート化させるが、ROCKiが副次的に持つミオシンのリン酸化阻害作用も働いて細胞間接着が低下し、細胞シートに穴があく問題点が浮上した。そこで、ROCKi添加培地にCa2+を添加してミオシンのリン酸化を補填させると、細胞間接着強度が増し、細胞シートとして回収することができた。
さらに、新規培養条件で作製する細胞シートをコラーゲンゲル上に接着させて培養すると、従来法で作製する細胞シートよりも3倍もの範囲に遊走しており、創傷治癒効果が高まったことが示唆された。このように、ROCKiとCa2+の組み合わせは、上皮細胞シートの枚数を増加させるとともに、性質も向上させる培養条件を確立することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞シートを安定して作製する条件最適化を行ったため、当初の計画からはやや遅れが生じたが、条件最適化で科学的に重要な知見を見出し、論文として投稿中である。また、コラーゲンゲルへ接着させると従来法で作製する細胞シートよりも創傷治癒能が増大した様子を捉え、当初の計画に準ずる結果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞シートをコラーゲンゲルのみならず、コラーゲンディッシュなどの基材へ接着させて挙動観察をすすめる方針である。
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| Causes of Carryover |
現在までの結果について論文投稿中であるため、論文掲載料の請求を想定していた。また、予定していた学会の参加費・旅費についてコロナウイルスの理由で延期となった。来年度にこれらの費用を割り当てるため、繰り越しとなった。
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