2019 Fiscal Year Research-status Report
A study to elucidate influence of triplet repeat expansion on pathology in Fuchs endothelial corneal dystrophy
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18K16947
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宮井 尊史 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (40599007)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Fuchs角膜変性症 / 角膜内皮細胞 / TCF4 / トリプレットリピート / RNA seq / 全ゲノムシーケンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
In vitro実験では、不死化角膜内皮細胞株HCEnCに対してTCF4 intron2のCTGリピートを挟む様なguide RNAを持つCRISPR/Cas9を発現するpX458を用いてリピート切断を行った細胞と切断前の細胞についてT7E1 endonuclease cleavage assayではOff-targetの切断は認められなかった。RNAseqを行い、発現遺伝子の違いを確認した。
80repeatのドナーのノックイン実験ではCRISPR/Cas9プラスミドの導入ができた細胞に対してドナーの挿入が認められなかったため、HDR用の60リピートのドナーを作成して、今回はHDRの機序を用いてリピートのノックイン実験を再試行するところである。
また、外来のFuchs角膜内皮変性症患者から採取した41人分のDNAに対してSTR assayおよびRepeat primed PCRを行い、TCF4のリピート伸長は8人(19.5%）に認められた。また本邦で多い遺伝子変異を調べることを目的に24名分の全ゲノムシーケンスを行い、リピート伸長についてはCA10が10名、TCF4が2名（STR assay等の結果に一致）、DMPKが2名、ATN1が2名に認められた。また、既報の遺伝子変異としてLOXHD1の変異1名、COL8A2の変異2名に認められた。また、角膜内皮に特異的に発現している遺伝子としてCAGEseq（Yoshihara 2017)の結果および東北メガバンクおよびExacのアレル頻度＜0.01、コントロール症例のアレル頻度＜0.01で絞り込みを行ったところ8遺伝子18変異に絞り込むことができた。
FECDの角膜移植検体3検体と正常角膜6検体の角膜内皮からRNAを抽出し、RIN値が低い検体が含まれるためSMART法によるRNAseqを行った。FECDで有意に発現上昇している遺伝子群のPathway解析よりPI3K-Akt signaling、Focal adhesion、ECM-receptor ineractionに関する遺伝子群の上昇が認められた。
動物実験については、CRISPR/Cas9を用いたTCF4のリピート伸長マウスを作成する予定で、ドナーが完成し、これから動物を作成するところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
外来患者からのDNAの解析、角膜移植患者からのRNAの解析、セルラインを用いたin vitroのノックアウト、ノックインの研究、動物実験におけるモデル動物作成において4年目の研究計画の2年目としては十分な進捗が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroでは不死化角膜内皮細胞に対して、TCF4intron2に対して60リピートのドナーを用いてHDRによるノックインを行い、細胞の表現型、細胞増殖曲線、RNAseqによる発現遺伝子について、コントロールおよびノックアウト細胞との比較を行う予定である。
動物実験では、CRISPR/Cas9によるTCF4のCTGリピート伸長マウスを作成し、角膜内皮細胞の表現型解析、内皮細胞の遺伝子発現の解析を行う予定である。
外来患者のDNA解析、角膜移植患者のRNA解析では引き続き検体数を増やして解析を行う予定である。
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[Journal Article] Ultraviolet A light induced DNA damage and estrogen-DNA adducts in Fuchs endothelial corneal dystrophy causing females to be more affected.2020
Author(s)
Liu C, Miyajima T, Melangath G, Miyai T, Vasanth S, Deshpande N, Kumar V, Ong Tone S, Gupta R, Zhu S, Vojnovic D, Chen Y, Rogan EG, Mondal B, Zahid M, Jurkunas UV.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 117
Pages: 573-583
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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