メラトニンレセプター制御による緑内障性視神経障害に対する神経保護に関する検討

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16970
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 田片 将士 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (60617984)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: メラトニンレセプター / 緑内障 / 網膜神経節細胞

Outline of Annual Research Achievements

Sprague-Dawley ラットに40nM N-methyl-D-aspartate(NMDA)を1μM硝子体へ投与し、正常眼圧緑内障モデルを作製した。正常眼圧緑内障モデルラットにMT1/MT2アゴニストであるAgomelatine、MT1/MT2アンタゴニストであるLuzindole、コントロールPBSを各群に分けて腹腔内投与し、投与12時間後、1日後、3日後、7日後で網膜を摘出し網膜ホールマウント切片を作成した。正常コントロールラットと正常眼圧緑内障モデルラットでメラトニンレセプターの発現数についてMT1 receptor抗体 ,MT2 receptor抗体にて免疫染色を行った。コントロール群と正常眼圧緑内障モデル群で単位面積当たりの発現数の差はみられなかった。また、網膜神経節細胞のマーカーであるBrn-3a抗体を用いて免疫染色を行い、各群の単位面積当たりの陽性細胞数をカウントした。Agomelatine投与群、Luzindole投与群、コントロールPBS投与群でBrn-3a陽性細胞はAgomelatine投与群でcontrol群と比べやや多い傾向にあり、Luzindole群でやや少ない傾向にあったが、統計学的有意差は見られなかった。また、NMDA投与後12時間後、1日後、3日後、7日後で網膜を採取し、細胞死に関連するCaspase3/7,Caspase8,Caspase9,Bcl-2,Baxの分子変動を検討した。NMDA投与後12時間以降でCaspase3/7,Caspase8,Caspase9,Baxは上昇していたが、コントロール群とAgomelatine、Luzindole投与群との間で有意差を検出することは出来なかった。また、Bcl-2はAgomelatine群で増加、コントロール群、Luzindole群ではAgomelatine群と比べ減少していた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初計画したプロトコールに沿って免疫組織学的検討・アポトーシスマーカーについて解析し検討を行う中で想定しているtime courseよりも早期での分子変動の可能性が示唆された。Caspase3,Caspase8,Baxは当初のプロトコールでのNMDA投与後1日目が最も高値を示し、その後、3日、7日と時間経過とともに減少する結果となったため、NMDA投与1日後よりも早期のtime courseでの検討としてNMDA投与後12時間の時点での検討を従来のプロトコールに加えて検討を行った。それに伴い、生存網膜神経節細胞数についても同時に解析する必要がありプロトコールに追加した。また、既報のプロトコールを参考として網膜神経節細胞の網膜よりの単離を試みているが、難航しており当初の予定よりも研究が遅延していることから上記区分とした。

Strategy for Future Research Activity

NMDA投与による正常眼圧緑内障モデルに対するメラトニンレセプターへのagonist、antagonist、PBS投与による生存網膜神経節細胞数に差がある傾向はみられたものの統計学的有意差はみられなかったため、N数を増加させて追加検討を行う予定である。
In vitro実験について網膜神経節細胞の単離、培養について既報などを参照して、再度手技的問題・培養条件などの検討を行い、参考としている既報以外の論文なども複数確認し研究を進める。

Causes of Carryover

実験計画が遅延していることから当初使用予定であった使用額に差異が生じたため。繰越金額については補助事業期間の延長が承認されたため、引き続き実験計画を遂行するために用いる。