2019 Fiscal Year Research-status Report
type I およびtype IIIコラーゲンによる歯根膜細胞の機能・分化制御
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18K17086
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
藤田 和久 東京医科歯科大学, 歯学部, 非常勤講師 (80805747)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 生体材料 / 再生医療 / 無機材料 / チタニア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯と歯槽骨を結合する歯根膜組織は，多種多様な細胞群を含む線維性結合組織であり，骨とセメント質の2つの硬組織に囲まれているにもかかわらず石灰化せず，その厚さが一定である生体内でも稀有な組織で，歯周組織の恒常性の維持を担う．歯科診療において近年，幅広く用いられているインプラント治療は，この歯根膜組織が存在しないため，インプラント体周囲の歯周組織のリモデリングが行われず，加齢等による生体反応への適応性が低い．また，天然歯において歯周組織は細菌感染に対するバリア機能を発揮するが，インプラントによる治療が細菌感染に対して抵抗性が低い原因も，歯周組織の欠損に由来する．酸化チタンがコーティングされたチタンインプラントは生体活性が高く，近年では，埋め込み型生体材料の第一選択の材料とされている．酸化チタンは，一般的な合成を行うと｛101｝面が約95%を占めるが，適切な阻害剤を用いることにより｛001｝面が露出した酸化チタンを合成することが可能となる．｛001｝面は｛101｝面と比較して，表面自由エネルギーが高いことから種々のイオンやたんぱく質が吸着しやすく，また，その光触媒作用が高いことが報告されている．本年度は，作製したチタニアナノシートをインプラント材料にコーティングする技術の検討と，その細胞に対する影響を評価した． 高次構造を有するチタニアナノシートは通法によりコーティングを行うと，ランダムにコーティングされ｛001｝面および｛101｝面の配向性が損なわれるが，適切な分散材とpHのもとコーティングを行うことにより｛001｝面が多く露出したインプラント材料が作製された．しかしながら凝集が認められることからさらなる検討が必要である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本年度は， ヘキサフルオロチタン酸アンモニウムとチタンブトキシドを出発原料とし，水熱合成によりチタニアナノシートを作製した．フッ素とチタンの仕込み比を，1.0 （NS1.0），1.5（NS1.5）とし作製したチタニアナノシートは，アナターゼ型チタニアで，平均サイズが30nmおよび100nmであった．UV照射により，それぞれの試料においてハイドロキシルラジカル及びスーパーオキサイドが生成した．ハイドロキシルラジカル及びスーパーオキサイドの生成量を比較したところ，それぞれNS1.5，NS1.0において最大の発生量を示し，絶対量としてNS1.0 が最も多く活性酸素種の発生した．また，カバーガラスへのコーティングを試み，溶媒のpHを変化させコーティングを行ったところ，低pHの際に｛001｝面が多く露出することが明らかとなった．さらに近年，歯科用インプラント材料として利用が拡大されている歯科用ジルコニアへのコーティングを行った．歯科用ジルコニアには，3mol%イットリア部分安定化ジルコニアを用いた．ジルコニア粉末を一軸加圧成形により圧粉体を作製し，1450℃2時間焼結した．焼結したジルコニアに作製したチタニアナノシートをコーティングした．本試料上で骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞を培養し，その増殖能を検討した． 前培養したMC3T3-E1細胞を，一定数試料上に播種し，培養後，1，3，7日後の細胞数をルシフェラーゼアッセイにより評価した．なお，本研究では焼結したジルコニア試料を対象群とした．いずれの試料においても細胞数は増加したものの，試料間において有意差は認められなかった．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，階層性チタンインプラント材料の開発のため，歯根膜線維芽細胞のセメント芽細胞・骨芽細胞へのパラクライン的作用を明らかにするために，セルカルチャーインサートにチタニアナノシートをコートしたジルコニアを静置し歯根膜線維芽細胞を播種する．また，細胞培養用ディッシュにはセメント芽細胞・骨芽細胞を播種し，共培養を行うことにより歯根膜線維芽細胞から分泌されたタンパク質の発現をELISA法にて検討を行う．また，細胞間相互作用の影響を明らかにするために，チタニアナノシートをコートしたジルコニアに歯根膜線維芽細胞を接着させる．接着完了後，細胞を含む試料を新しい細胞培養シャーレに移し，その周囲にセメント芽細胞・骨芽細胞を播種し，一定器官培養後，細胞間相互作用の検討を，タンパク・遺伝子レベルで検討する．特に，細胞間相互作用にかかわるカドヘリンを介したシグナリングカスケードを解析する．また，セメント芽細胞・骨芽細胞による硬組織形成能は，体液中のカルシウムイオンとリン酸イオンの過飽和状態と細胞外基質によるヘテロジーニアスな結晶成長と考えられている．セメント質の有機成分は，III型コラーゲンが多く発現し，一般的な骨の硬組織形成とそのメカニズムが異なることが考えられるため，形成された硬組織の評価を走査型電子顕微鏡や，顕微FTIRを用いて評価を行う．以上により最適化された細胞外基質を参考に，チタンインプラントの表面に歯周組織を模した構造を付与し，歯根膜由来細胞の3次元細胞培養を行い，歯根膜組織およびセメント質・骨などの硬組織形成能を，実験動物を用いてインプラント体を埋入し組織学的に評価する．
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| Causes of Carryover |
未使用額が生じた理由は，試料の作製に想定以上に日数を要したためである．未使用額と次年度使用額を併せて以下の項目に関して使用する予定である．①研究成果発表のための旅費（国内会議，国際会議）②試料作製に必要な薬品，消耗品の購入③細胞実験のための必要な薬品，消耗品，解析用試薬④動物実験のための必要な薬品，消耗品，解析用試料作製のための薬品，試料滅菌のためのガンマ線滅菌費用など．
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Research Products
(1 results)
