網羅的遺伝子解析を用いた、老齢マウスにおける骨欠損修復メカニズムの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K17110
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 猪狩 洋平 東北大学, 歯学研究科, 助教 (10734270)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 老化 / 骨欠損修復 / 網羅的遺伝子解析 / マウス

Outline of Annual Research Achievements

老化が骨欠損修復に与える影響については生物学的知見が乏しく、老齢個体の骨修復における分子メカニズムは未だ不明である。そこで、本研究計画は「高齢者と若年者とで、骨欠損修復における分子メカニズムは異なるのか」を調べることを目的とする。
当該年度は、マウスを用いた骨欠損修復モデルを確立し、修復骨量を調べるために当初予定していなかったマイクロCT解析を追加することを決め、その予備的実験を行った。
まず、マウス頭頂骨に作製する規格化骨欠損のサイズを検討した。直径3.8mm、3.3mm、3.0mm、2.4mmの4サイズのトレフィンバーを用いて左側頭頂骨に骨欠損を作製したところ、直径2.4mmのトレフィンバーが矢状縫合にかからず最適な大きさであることが分かった。
次に、サンプリングのタイムポイントを決めるために、直径2.4mmの骨欠損を生後10週齢の若齢マウス頭頂骨に作製し、術後2週，4週，6週，8週で骨欠損作製部位を含めた頭頂骨を摘出し、4％PFAで固定後、予備実験的にマイクロCT撮影を行った。術後8週でも骨欠損が修復骨で埋まらなかったため、新たに術後12週もサンプリングの対象とすることにした。
現在、若齢マウス・老齢マウスともに頭頂骨に規格化骨欠損を作製し、術後2週，4週，6週，8週, 12週でサンプリングを行い、固定後にマイクロCT撮影を行っているが、画像データの解析には至っていない。また、マイクロCT撮影後の試料は脱灰後にパラフィン包埋し、組織学的検討に使用する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

若齢マウスについてはおおむね予定通りサンプリングが行えているが、本研究計画で用いる老齢マウスは生後50週の個体であるため、飼育に多大な期間を要することから、老齢マウスのサンプリングに遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

引き続きマウスを飼育し、50週齢の老齢マウスの個体数を維持しつつ、若齢マウスと老齢マウスの頭頂骨に直径2.4㎜の規格化骨欠損作製する。術後2週，4週，6週，8週, 12週の各タイムポイントで骨欠損部位を含めた頭頂骨を摘出し、固定後、マイクロCT撮影を行う。
それと並行して、若齢マウスと老齢マウスにおいて、同サイズの骨欠損作製後2週あるいは4週で骨欠損内部にできた修復骨を採取し、超音波ホモゲナイザーで破砕後、トータルRNAを抽出する。RNAサンプルをラベル化してマイクロアレイにハイブリダイズし、スキャニング後、専用の解析ソフトを用いてDNAマイクロアレイによる解析を行う。マイクロアレイの結果、老齢マウスと若齢マウスとを比較して特徴的な遺伝子発現を示した分子について、骨修復過程におけるmRNA発現を定量解析し、統計学的に比較検討を行う予定である。

Causes of Carryover

本研究で使用する老齢マウスの飼育には多大な時間を要するため、当初予定した実験を行えず、そのために未使用金額が発生した。
当該年度に行う予定であった老齢マウスのマイクロCT解析や次年度に予定しているDNAマイクロアレイ解析と組織学的解析を行うための費用として次年度請求額と合わせて使用する予定である。