Analysis of the effect of anti-resorptive drugs on bone remodeling using 2-photon microscopy

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K17163
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 松山 真理子 東京大学, 医学部附属病院, 客員研究員 (90738725)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 骨リモデリング / カップリング / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

骨リモデリングをin vitroにおいて再現し、2光子顕微鏡を用いて解析可能な系を用いて、各種骨吸収抑制剤が骨リモデリングにおける細胞動態および基質変化に及ぼす影響を解析した。
平成30年度は、カテプシン阻害剤E64の骨リモデリングに対する影響を検討した。EGFPマウス骨芽細胞を分化培地で4~6週間培養し、その後RANK-CreマウスとROSA-LSL-tdTomatoマウスを掛け合わせたマウスから採取した骨髄細胞と3週間共存培養した（吸収期）。その後再び骨芽細胞分化培地で3週間培養した（再充填期）。両期を通じてE64を添加、あるいは無添加の群を設定した。2光子顕微鏡を用いて毎週観察を行った結果、無添加群では基質吸収とそれに引き続く再充填が見られたが、E64添加群では基質吸収が抑制され、再充填期には吸収窩以外の部位でも基質の増加がみられた。基質量の定量解析では、E64添加群では吸収が抑制されたが、引き続く増加は抑制されなかった。さらに、培養上清のELISAでは、無添加群のみで共存培養開始後CTXが上昇した。一方、Gla-Osteocalcinは両群とも共存培養開始後の低下と、再充填期の上昇が見られた。
令和元年度は、上記観察に加え、位置情報を加味した定量方法の検討を行った。具体的には、画像を複数の領域に分割し、各領域における基質の増減を定量化することで、基質の吸収と再充填のカップリングについて検討を行った。無添加群では、基質吸収部位において、吸収量と形成量に一定の相関、すなわちカップリングがみられた。一方、E64添加群では、基質が減少した領域が少なく、吸収量と形成量の相関も見られず、カップリングが大きく乱れていた。
令和2年度には、さらに解析を進め、基質変化と骨芽細胞の量および形態、破骨細胞量および破骨細胞の大きさについて、分割した領域ごとに定量化し、基質変化との関連を評価した。