パラジウムに反応する特異的T細胞受容体の遺伝子導入細胞株や遺伝子導入マウスの作製

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K17215
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 武田 裕利 東北大学, 大学病院, 助教 (60806339)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 金属アレルギー / パラジウム / T細胞受容体

Outline of Annual Research Achievements

申請者はパラジウム（Pd）に反応する病原性T細胞に着目し、金属アレルギーにおける抗原提示の分子機構を明らかにすることを目的とし、本研究を遂行するために、申請者が特定したPdアレルギー特異的なTCRαを用いて遺伝子導入細胞株および遺伝子導入マウスを作製することとした。これまでにPd特異的TCR遺伝子導入マウスを作製し、現在研究に使用できる世代まで交配を進めている。これまでにヒトの金属アレルギー特異的TCR遺伝子導入細胞を用いたin vitroでの研究はみられるものの、ヒトでは過去に多種金属に曝露されていることなどから過去に同定された金属アレルギー特異的TCRということについて議論の余地がある。そのため今回マウスを用いた単一の金属に曝露されたPd特異的TCRを発現した遺伝子導入細胞を用いてin vitroでの研究を行うことでより詳細なメカニズムや抗原提示状況の更なる解明へ繋がると考えている。またPd特異的TCR遺伝子導入マウスを構築することにより、金属高感受性マウスとして、金属材料安全性試験の確立に役立つことやin vivoでの金属アレルギー発症のメカニズムを解明できること考えている。今年度の実績は、作製したPd特異的TCR遺伝子導入マウスを研究できる世代まで交配し、野生型マウスと同様にPdアレルギーを発症させ、症状の程度ならびにサイトカイン産生などの免疫応答などを調べている。興味深いのは惹起した部位の腫脹が強く、明らかに野生型よりも反応が強く出ていた。また現在、サイトカイン産生やT細胞の集積は経時的変化を含めて、調べている状況である。また抗原提示状況に関して、MHCに着目し、MHC Class I分子またはClass II分子の発現を抑制したPd抗原提示細胞を養子移入しアレルギー発症をみたところ、MHC Class I分子の発現を抑えた群ではアレルギー反応も抑えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID-19感染拡大に伴い、研究もなかなか進められなかったが、申請者はすでにPdアレルギー特異的なTCRα鎖の特定を行っており、昨年度は申請者が設定した６ステップの実験計画のうち、4. 「Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの飼育・維持」まで進んだ。現在は実験に使用できる世代まで交配を続けている段階である。次世代が産まれたら、固体からPCR精査を行い、確実にPd特異的TCRα鎖が発現しているものを交配しており、実験に使用できるマウスを交配し、今年度は以下の実験を施行した。Pd特異的TCR遺伝子導入マウスを用いての免疫応答を調べている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進としては、設定した実験計画に従って、研究を進めていく。COVID-19感染拡大の影響で、なかなか計画通りに実験が進められなかった。特に遺伝子導入細胞株の作製はなかなか進まなかったため、早急に遺伝子導入細胞株の作製に取り掛かる計画を立てる。具体的にはPd特異的TCR遺伝子導入細胞株の樹立に関しては６ステップの実験計画のうち、4. 「TCRα－β－細胞株にウイルスベクターを用いて遺伝子導入する」、5. 「Pd特異的TCR遺伝子導入細胞をセルソーターで回収し、蛍光顕微鏡で確認する」のこの作業をPd特異的 TCRβ鎖の候補を用いて行い、α鎖、β鎖の両方を導入した遺伝子導入細胞を作製する。次に6. この遺伝子導入細胞とPd処理した抗原提示細胞を共培養し、サイトカイン産生やT細胞の活性化、より詳細な抗原提示状況などをin vitroで解析することに対して研究を進めていく。Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの作製に関しては4. 「Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの飼育・維持を行い、研究に使用できる世代まで飼育を行う」ことを行なった。今年度は以下の実験を施行した。Pd特異的TCR遺伝子導入マウスを用いての免疫応答を調べている。に通法の金属アレルギーの感作・惹起を行い、皮下におけるアレルギー反応（特に惹起部の腫脹・発赤）について調べたところ、WTマウスと比較した。
アレルギー発症に伴いサイトカイン産生やT細胞の活性化の解析を行い、in vivoでより詳細な抗原提示状況を明らかにする手順で研究を進めていく予定である。具体的には通法のアレルギー発症のプロトコルに従い、アレルギー発症の程度を確認する。また所属リンパ節や発症した組織を用いてサイトカイン産生や集積するT細胞のサブセットの確認、そのT細胞のサイトカイン産生量などを把握していく。

Causes of Carryover

COVID-19感染拡大流行に伴い、学会参加・発表ができない状況であり、研究の信仰にもやや制限がかかったことから物品購入や旅費に伴う支出がなかった。当年度の研究における物品・消耗品は所持しているもので足りており、積極的に購入が必要なものはなかった。次年度は学会発表における旅費や論文投稿における投稿料、研究進行に伴う消耗品を購入にあたり、諸費用が必要である。