2018 Fiscal Year Research-status Report
歯由来の間葉系幹細胞におけるTh1系サイトカインによる新規分化誘導調節機構の解明
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18K17226
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
石田 陽子 広島大学, 病院(歯), 歯科診療医 (00772055)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 間葉系幹細胞 / 歯小嚢由来幹細胞 / 歯乳頭由来幹細胞 / 炎症性サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
幹細胞は，自己増殖能および多分化能を有する細胞と定義され，生体諸組織に分布することが知られている。とくに，間葉系幹細胞の有する骨芽細胞や軟骨細胞 への分化能は再生医療の中でも，注目されている。骨髄系間葉幹細胞以外にも様々な組織から存在が報告されているが，口腔領域では，歯髄由来の間葉系幹細胞 の増殖能や多分化能が報告されている。しかしながら歯乳頭細胞，歯小嚢細胞由来の間葉系幹細胞の生物学的特性，分化能力の違いには不明な点が多い。また間葉系幹細胞は傷害された組織や炎症を生じた組織において免疫制御機構を発揮することが知られている。特に，口腔内の炎症組織には，Th1 細胞から誘導される炎症系サイトカインであるIFN-γ，TNF-αの発現が認められる。申請者は予備実験で，歯乳頭，歯小嚢由来の間葉系幹細胞の細胞学的性質が異なっていること，また炎症性サイトカインがそれら間葉系幹細胞の骨分化能力を抑制することを発見した。今回の実験計画では同一患者から歯乳頭細胞，歯小嚢細胞由来の間葉系幹細胞を分離し，生物学的特性や分化能力の比較を行うこと，さらに炎症系サイトカインによる分化能の調節機構とそれに関与する新規分化誘導関連遺伝子を明らかにし，再生医療への応用を検討することである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者の過剰歯から歯小嚢，歯乳頭組織を採取し， Balliniらの方法によって幹細胞の単離を行った。得られた幹細胞の生物学的解析を行った。これらの幹細胞における，幹細胞マーカーの解析をフローサイトメトリー法によって行った結果，CD90, CD73 などの幹細胞マーカーが陽性であることが示された。さらにこれらの細胞を分化誘導培地で分化させ，骨分化誘導能，脂肪分化能，軟骨分化能を検討した結果，得られた細胞が骨分化，脂肪分化，軟骨分化能をもつことが示された。
これらの細胞を用いて，IFN-γ，TNF-α単独，あるいは同時添加を行い，アニザリン染色法にて骨誘導能の比較を行った。歯小嚢，歯乳頭幹細胞ともにIFN-γ単独添加で骨誘導が抑制されることが示唆された。歯乳頭幹細胞ではTNF-α単独添加において骨誘導が抑制されたが，歯小嚢幹細胞ではTNF-α単独添加における骨誘導の影響は認められなかった。また歯小嚢幹細胞においてIFN-γ誘導性の骨分化の抑制がTNF-α同時添加によってさらに増強された。
以上の結果を得ており，現在のところ実験計画は概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
IFN-γ，TNF-α単独添加，同時添加による分化能の調節機構に関与するシグナルを明らかにするため，各種シグナル伝達阻害剤を含む分化培地にIFN-γ，TNF-αを添加し，IFN-γ，TNF-αの影響を阻害するシグナル伝達阻害剤を同定する。さらに，サイトカインによる分化調節に関連する蛋白の同定を行うために，サイトカインシグナル伝達阻害に関連する蛋白のリン酸化誘導などを検討し，関連蛋白を同定する。
IFN-γ，TNF-αによる分化に関与する遺伝子を明らかにするため，歯小嚢，歯乳頭細胞にIFN-γ，TNF-α添加後，分化誘導を行った後，細胞を回収，マイクロアレイを行い，誘導，あるいは抑制される遺伝子群の網羅的解析を行う。特に影響を受けた遺伝子を同定する。同定した遺伝子群のsiRNA をカスタムメイドし，歯小嚢，歯乳頭，骨髄由来幹細胞に細胞導入する。その後，分化誘導を行い，分化能力の比較を行う。
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| Causes of Carryover |
幹細胞の単離，性質解析に時間がかかり蛋白解析やマイクロアレイまでいたらなかったために次年度使用額が生じた。次年度で前年度の助成金を合わせ、物品費として使用することを検討している。
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