2018 Fiscal Year Research-status Report
Low Km ADH1およびHigh Km ADH3とアルコール性臓器障害
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18K17421
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
勝山 碧 日本医科大学, 医学部, 助教 (90803700)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アルコール / 腎障害 / 腎病理 / アルコール脱水素酵素 / ADH1 / ADH3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、アルコール代謝の鍵酵素であるAlcohol dehydrogenase class I (ADH1) およびエタノールに高いKmを持つAlcohol dehydrogenase class III (ADH3) が共に肝の次に腎に多く分布していることに着目し、マウス腎でのアルコールの影響および障害について検討した。
8週齢雄のC57BL/6N(Wild)マウス、Adh1ノックアウト(KO)マウス、Adh3KOマウスに水(C群)あるいは10%アルコール(Alc、E群)を１か月摂取させ、尿・血清・腎を回収した。生化学的探索として尿から尿量、クレアチニン、アルブミン、総蛋白質、グルコース、浸透圧、テストステロンを測定し、血漿からクレアチニンを測定した。病理学的探索のために、光顕（HE染色、PAS染色）および電子顕微鏡を用いて検討した。
生化学的探索ではAlc投与により腎障害診断基準の一つであるアルブミンが有意に多く排泄することが明らかになった。光顕では両群で糸球体ボーマン嚢上皮細胞の立方化が観察された。立方化したボーマン嚢上皮細胞をポイントし、数を計測したところ、WildではC群よりもE群に有意に多く観察された。この観察から、Alcが糸球体ボーマン嚢上皮細胞の立方化を促進したと考えられる。一方、KOマウスは水投与で立方化が観察された。次に電顕で立方化部分を観察したところ、通常は扁平な上皮細胞の内部に刷子縁が存在しており、通常みられる上皮細胞に重なるように刷子縁を持つ立方化部分が糸球体内部を囲んでいた。立方化は近位尿細管が入り込んで出来ている可能性が示唆され、立方化部分で再吸収を行なっている可能性が考えられる。
以上より、Alcが腎の形態的および機能的変化に関係していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の30年度の計画は、1)血中Alc濃度の測定と代謝速度の算出、2)Alc代謝関連酵素の測定、3)Alc代謝関連酵素の発現量の測定、であった。
腎への慢性Alc摂取の影響および障害を探索するために、当初予定していなかった電子顕微鏡での観察および尿・血清中の生化学的評価を行ったため、計画よりやや遅れている。また、Adh1KOマウスは10%Alc投与では1か月経過後死んでしまうが5％Alc投与では1年以上生存することから、5％Alcと10％Alcがマウスに及ぼす影響の違いの検討も行っている。
腎生理および腎病理を明らかにした上で1)2)3)について適宜着手したいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
8週齢雄Wildマウス、Adh1KOマウス、Adh3KOマウスのC・E群に対して下記7点を実施する。
31年度：1)5％Alc投与1か月後に尿から生化学的探索を、12か月後に尿・血清・腎から生化学的・病理学的探索を行う。2)10％Alc投与12か月後に尿・血清・腎から生化学的・病理学的探索を行う。3)腎抽出液を作製し、ELISA法でADH1およびADH3の酵素量を分光プレートリーダーで測定する。4)腎からRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてmRNAを抽出し、SYBER Green法にてRT-PCRを行い、ADH1およびADH3の発現量を測定する。
来年度以降：5)凍結切片を作製し、Digoxigenin標識ADH1 cRNAプローブとDigoxigenin標識ADH3 cRNAプローブを作製し、In situ ハイブリダイゼーション法でADH1およびADH3のmRNAの局在を可視化する。6)酵素抗体法でADH1およびADH3の蛋白発現を観察し、mRNAと蛋白の分布とその強度を光学顕微鏡下（現有）で定量する。7)4の結果と併せて、ADH1およびADH3のmRNAと蛋白の活性分布と量的変動を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
30年度に行う予定であったAlc代謝関連酵素の発現量の測定を31年度以降に変更したため。
31年度以降にRNA抽出キット、逆転写試薬、RT-PCRキットを計上する。
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Research Products
(10 results)
