2018 Fiscal Year Research-status Report
生物分子マシンの作動原理を理解する：共振現象による計測と制御
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18K18731
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
今清水 正彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (90465930)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | テラヘルツ / 転写複合体 / 熱揺らぎ / ハイスループットDNAシーケンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質や核酸等から成る生物のナノマシンは、水溶液中で、熱運動を利用して正確に作動する。この仕組みは未解明である。この問題の難しさは、(1)どの程度問題を掘り下げれば一般的な解明と言えるのか？(2)どう実験的に検証するのか？という点である。本研究では、転写複合体をモデルとし、(1) この問題を活性化エネルギーの概念で説明できない化学反応機構の問題として捉え、(2) 活性化エネルギーよりも十分に小さく、室温の熱揺らぎ程度のエネルギーを持つ電磁波であるテラヘルツ （THz）光を照射し、その生化学反応への波長依存的な効果を統計的に評価する新技術を開発し、実験的な検証を試みた。具体的には、0.1THz光源と5THz光源を用いて、微量水溶液中の転写複合体試料に、基質添加と同時に高強度THz光を90秒照射した。試料の平均温度上昇は室温から~0.3℃に留めた。転写反応の主要過程（転写開始、一時停止、終結、読み誤り）へのTHz照射の影響を高感度に検出するために、ハイスループットDNAシーケンシング（HT-seq）法を利用した方法を新たに開発した。また、試料の水温だけを上昇させる対照実験を行い、熱的効果との違いを徹底的に検証した。開発した新技術を用いて、特定波長のTHz光照射は、温度上昇とは質的に逆の影響を複数の転写過程に与えるという新知見が得られた。
THz照射実験において、保科宏道上級研究員（理研）と田中真人主任研究員（産総研）の協力を得た。また、5THz光源として、大阪大学産業科学研究所の磯山悟朗特任教授らが開発した自由電子レーザーを用いた。0.1THz光源として、産総研・計量標準総合センター保有のクライストロンを用いた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一般的に、THz 光と生体高分子の直接的相互作用が生物機能を変化させるかどうかを実験的に検証することは容易ではない。分光的な検出を試みる場合、THz領域のスペクトル変化から生体高分子運動の微視的な情報を読み解き、さらにその情報を生物機能と結びつける必要がある。一方、THz光による効果を生物学的な変化の側から調べる場合、熱的効果との分離を含め、THz光照射と生物学的な変化の直接的な因果関係を特定するための工夫に加え、得られた現象の分子機構を推定する工夫が必要である。本研究では、分子機構の理解が進んだ生物ナノマシンである転写複合体の水溶液試料にTHz光を照射し、その機能変化を１００万以上の核酸分子を１塩基分解能で扱えるHT-seq法を用いて解析した。この方法であれば、RNAポリメラーゼにより転写される莫大数のRNA分子の変化を高感度で検出でき、かつ結果を統計的に評価することが可能である。得られたHT-seq実験プロファイルを既知の分子機能情報と照合すれば、転写反応において、THzが影響を与えたであろう分子過程をある程度絞り込むことができる。本研究で開発したTHz光照射HT-seq検出により観察されたのは、温度上昇から期待される転写伸長反応の促進というよりむしろ、伸長反応一時停止の促進であった。この過程には活性化エネルギーが無く、熱揺らぎが支配的であることが知られている。本研究から、THz 光による生化学反応への効果を、水を介した熱的な効果から分離できる可能性が新たに示唆された。上述した新知見を、海外および国内における複数分野の学会と招待講演で発表し、研究成果を国際的に発信した。以上が、現在までの進捗が順調と評価した理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究では、転写反応のハイスループット観測において、THz光照射による効果を熱的効果と分離し得るかどうかに重点を置いた研究を行なった。２年目以降は分子機構に迫る研究を展開するため、THz光照射条件（周波数、パルス幅、ピークパワー等）を変えた計測を行う。THz光と生体高分子の直接的相互作用についての微視的な情報を得るには、より狭い領域で周波数依存性を調べる必要がある。また、THz光の転写反応への効果をHT-seq法を用いて高感度に検出する場合、実験中のわずかな室温変化による影響をTHzの影響と誤認する可能性がある。このため、試料セルおよび反応試薬類の温度を厳密にコントロールするための温調設備を導入する。
得られた現象が、THz光と転写複合体との直接的な相互作用に起因する場合、その構成分子である核酸あるいはタンパク質において、THz光の励起状態が十分に長い時間断熱的に保たれることが期待される。しかし、そのような現象の報告例はない。期待されるようなTHz光と生体高分子の相互作用を直接観測するためには、ナノフォトニクス分野の技術・概念や分光法を取り入れた新しい観測系の構築が必要になり、今後の課題である。さらに、機構論からテラバイオロジー（テラヘルツ領域のゆらぎ運動から生物機能を理解する新しいバイオロジー）へと展開していくため、細胞を用いた実験を行う。具体的には、メンブレン上に重なりを抑えて吸着させた大腸菌あるいは酵母を試料としてTHz光照射を行い、細胞内のゲノムワイドな転写変化やゲノムDNAの運動変化に基づいたエピジェネティック変化等をHT-seq法および遺伝学的手法を用いて調べる。
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