2019 Fiscal Year Annual Research Report
Toward introduction of microbial indicators: a new on-site measurement technology for microbes in wastewater treatment plants
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18K18877
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
山田 剛史 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (90533422)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川上 周司 阿南工業高等専門学校, 創造技術工学科, 講師 (00610461)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | アンモニア酸化細菌 / 亜硝酸酸化細菌 / メタノサルシナ属アーキア / Cell-SELEX法 / DNAアプタマー / 細胞表層タンパク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、複数種のアンモニア酸化細菌 (AOB) および亜硝酸酸化細菌 (NOB) を識別する機能性核酸分子を明らかにするとともに、機能性核酸分子修飾金ナノ粒子による定量法の確立を目的とした。昨年度までは、AOBとNOBの細胞表層タンパクに結合するそれぞれ18種のDNAアプタマーの獲得に成功していた。昨年度において、DNAアプタマーの特異性を評価するためにリアルタイムPCR法を用いたが、その定量値に問題があることが判明していた。本年度は、蛍光DNAアプタマーを用いて、AOBとNOBとの結合性の違いを蛍光測定プレートリーダーと蛍光顕微鏡で評価する方法に変更した。蛍光測定プレートリーダーでは、蛍光DNAアプタマーを微生物に結合させた場合の蛍光値と微生物が持つ自家蛍光との差を評価した。また、蛍光DNAアプタマーが標的微生物に結合しているかを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、AOBおよびNOBに選別した18種のDNAアプタマーは、特異性はおろか結合性が低いことが分かった。Cell-SELEX法の問題を検証するため、細胞構造に特徴があるメタノサルシナ属アーキアを対象とした選別を行った。メタノサルシナ属アーキアに特異的と結合すると思われる18種のDNAアプタマーは、メタノサルシナ属アーキアのみを特異的に識別するとともに、様々な結合強度を示すDNAアプタマーも獲得できた。その内、特にメタノサルシナ属アーキアの識別および結合能が高いDNAアプタマー2種を最終的なDNAアプタマーを得ることに成功した。
AOBとNOBで確立したCell-SELEX法は、DNAアプタマーの選別には有効に機能することが分かった。ただ、AOBとNOBは細胞構造に顕著な特徴が見られないため、その特異性を得るには、類似の細胞構造を持つ微生物を用いたカウンターセレクション回数を上げる必要が示唆された。
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