2018 Fiscal Year Research-status Report
Functional Model of Methane Generation Enzyme MCR Having Ni-containing F430 as a Cofactor
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18K19099
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20222226)
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2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 人工補因子 / F430 / ミオグロビン / ニッケル錯体 / メタン生成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メタン細菌ではメチル補酵素M還元酵素(MCR)が存在し、二酸化炭素代謝物の分解によるメタン生成が繰り広げられている。これにはコファクターF430とよばれるモノアニオン環状テトラピロール配位子に有するニッケル錯体が活性中心として働き、金属―炭素結合(Ni-CH3種)を介しながらメチル基の転移を促している。本研究での目的は、この非常に複雑なF430配位子の環骨格であるコルフィン環を含む酵素に対する厳密なモデル反応の再現や酵素が繰り広げている触媒反応への応用を図ることにある。具体的には、タンパク質マトリクスを駆使したF430の実践的機能モデルの創製と、メチル基転移酵素の詳細な反応機構への言及を目標とし、新しい生体類似触媒構築への可能性を模索する。
初年度は、コファクターF430のモデルとして、ニッケルをモノアニオン環状テトラピロール配位子であるテトラデヒドロコリンに挿入した人工補因子を設計、合成した。各種分光法及び結晶構造解析により人工補因子を同定し、アポタンパク質に挿入した。アポタンパク質にはヘムタンパク質であるミオグロビンを選択し、ヘムを除去した後、人工補因子を挿入し、還元条件下において再構成タンパク質を得た。複合化を確認し、ヨウ化メチルを基質とするメタン発生について評価したところ、人工補因子のみでは有意な量のメタンは検出されなかったが、再構成タンパク質において、触媒的なメタン発生を確認した。このことから本系がMCRの機能モデルとして働くことを確認した。今後はこの再構成タンパク質を基盤として、より天然の反応条件に近い条件下で作用するモデル及び人工酵素の構築をめざす。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度はまず、天然酵素の補因子であるF430のモデルとして、ニッケルのモノアニオン環状テトラピロール配位子であるテトラデヒドロコリンに挿入した人工補因子を設計し、合成した。同定は、NMR、EPR、可視紫外吸収スペクトル及びX線結晶構造解析により実施し、設計通りの化合物が得られていることを確認した。次に酸素貯蔵タンパク質であるミオグロビンについて酸性条件下で2-ブタノンにより処理することで、ヘムが除去されたアポタンパク質を得た。合成した人工補因子とアポタンパク質を混合し、再構成ミオグロビンの調製を実施した。可視紫外吸収スペクトル変化から解離定数を算出し、数十μMであり、強く結合していることが明らかとなった。さらにEPRやCDスペクトル測定から還元された1価の状態でミオグロビンのタンパク質マトリクス内に保持されていることが示された。またタンパク質とニッケル錯体の複合化は質量分析によって直接的に観測された。続いて、ニッケル中心の酸化還元電位を測定したところ、タンパク質中の人工補因子の酸化還元電位は人工補因子のみの場合に比べて正側にシフトしていることが明らかになった。このことから、反応性についても異なることが示唆され、実際に比較的弱い還元剤であるジチオナイト存在下でヨウ化メチルを炭素源とするメタン発生を試みたところ、人工補因子のみでは検出されないメタンが、再構成タンパク質の働きによって触媒的に発生することをガスクロマトグラフィーの測定から確認した。このことから本再構成ミオグロビンはMCRの機能モデルとして機能することを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開としては、F430のモデルとして人工補因子として合成したニッケルテトラデヒドロコリン錯体の改良とミオグロビンへの変異導入や他のヘムタンパク質マトリクスを利用することで、さらなる反応性の向上をめざし、天然のメタン発生酵素であるMCRの反応の再現をめざす。前者の人工補因子に関しては、ジテトラデヒドロコリンやビピリコロールのようにモノアニオンを維持したまま、高い反応性の活性種が期待される新たな錯体の設計及び合成を実施する。錯体の評価もこれまでと同様に詳細に実施する。後者のミオグロビンの変異導入に関しては、錯体の上部に存在する遠位のヒスチジンを嵩の小さなアラニンやメチル供与体となり得るメチオニンに置換する試みを実施する。また金属中心の軸配位子の置換は大きな反応性の変化をもたらすので、複合化が阻害される可能性もあるが積極的に試みる。現在はヒスチジンが配位していると考えているが、より強く配位するシステインや弱く配位するグルタミン等が配位する変異体とニッケル錯体の複合化を検討する。安定に複合体である再構成タンパク質が得られる場合はX線結晶構造解析を用いた詳細な構造評価も試みる。また構造が明らかになった場合、結晶に基質や還元剤を染み込ませ、中間体の直接観察にも挑戦したい。他のヘムタンパク質も積極的に用いて、物理化学的性質と反応性の変化を系統的に理解し、天然酵素の作用機序解明と人工酵素への展開を精力的に実施する。特に、本系は天然酵素に比べてまだ反応性が十分でないので、反応性の向上による天然の基質に近いメチル供与体によるメタン発生に注力する。
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| Causes of Carryover |
調製に関しては計画通り順調に進行したが、当初想定していたほどの十分な反応性がなく、メタンの生成量が少なかったため、触媒反応評価に時間がかかった。そのため時間のかかる結晶化については、高額の生化学消耗品が必要であるので、次年度以降に繰越して使用することとした。また反応機構解明のための同位体実験も実施予定であったが、より活性なモデルが作成できた時点で実施することとし、来年度以降、未使用額をこのための費用に充当する。
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