2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトミダシンタンパク質を標的とした新規低分子化合物の探索および解析
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18K19138
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
川島 茂裕 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任講師 (40508115)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | リボソーム生合成 / ミダシン / 低分子阻害剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低分子化合物は安価で大量に合成できるという大きな利点があり、新たなdruggableな標的とその標的を阻害する低分子化合物を同定することは挑戦的であるものの、人類の健康にとって大事な研究である。増殖の盛んながん細胞で亢進しているリボソーム生合成のプロセシング過程には200以上の調節因子が関与しているため、それらを標的とした阻害剤は抗がん剤の候補となりうる。しかしながら、現在までにヒトの調節因子に対する選択的な阻害剤は報告がない。本研究ではヒトにおけるリボソーム生合成調節因子、特にAAA+タンパク質であるミダシンの阻害剤の同定を目標とし、抗がん剤の新たなリード化合物の創製を目指す。今年度は、ヒトミダシン組換えタンパク質の精製を行い、in vitroにおけるATPase活性の測定系を確立することを目指した。応募者はこれまでにヒトミダシン全長遺伝子(16,791 bp)のクローニングに成功していたため、昆虫細胞発現用のプラスミドにヒトミダシン全長遺伝子を導入した。応募者らは以前の研究において、昆虫細胞・バキュロウイルスによる発現系を用い、His-tag精製、イオン交換クロマトグラフィー（Mono Q）、ゲル濾過クロマトグラフィーの順に精製することにより、ATPase活性のある分裂酵母ミダシンの全長組換えタンパク質を得ることに成功した（Kawashima SA et al. Cell
2016）。そこで次に、この方法を元にヒトミダシン全長組換えタンパク質の精製を試みた。しかし、ヒトミダシン全長タンパク質の発現は確認できたものの、分裂酵母のミダシンと同じ精製法では不十分であることがわかった。現在、ヒトミダシンのATPase領域だけをまずは精製し、活性があるか調べることを目指している。また、ヒトミダシン全長組換えタンパク質の精製に関しても最適化を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昆虫細胞発現用のプラスミドにヒトミダシン全長遺伝子を導入することにより、ヒトミダシン全長タンパク質の発現が確認できたことは進展である。一方で、分裂酵母のミダシンと同じ精製法では不十分であることがわかったため、ヒトミダシン全長タンパク質独自の最適な精製法の確立を目指すことになった。また、バックアップとして、ヒトミダシンのATPaseドメインのみの発現系を作った。全体としてはおおむね順調していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずはヒトミダシンのATPaseドメインを精製し、ATPase活性があるか調べる。また、ヒトミダシン全長組換えタンパク質の精製に向けて、昆虫細胞系の最適化および精製過程の最適化を行う。ATPase活性のあるリコンビナントタンパク質を精製できたら、応募者がこれまでに同定した分裂酵母ミダシンの阻害剤Rbin-1がヒトミダシンのATPase活性を阻害可能か検討する。また、応募者は分裂酵母ミダシンの温度感受性変異株と合成致死性を示す化合物として、現在までに東京大学創薬機構が保持している約20万化合物の中から、Rbin-1とは異なる骨格を有するヒット化合物を6化合物取得している。まずこれらが、分裂酵母ミダシンのATPase活性を阻害可能か検討する。もし阻害活性が見られたら、ヒトミダシンのATPase活性を阻害できるか調べる。
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| Causes of Carryover |
当初は、ヒトミダシン組換えタンパク質の精製を行い、in vitroにおけるATPase活性の測定系を確立する一連の実験に今年度の助成金を使用する計画であった。しかし実際は、ヒトミダシン全長タンパク質の精製のためには、分裂酵母のミダシンと同じ精製法では不十分であることがわかった。当初の使用計画であった、ヒトミダシン組換えタンパク質の精製を行い、in vitroにおけるATPase活性の測定系を確立する一連の実験は、次年度に延長して使用する計画に変更した。
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