2018 Fiscal Year Research-status Report
ドパミンニューロン分化誘導核内受容体Nurr1の制御によるパーキンソン病薬の創製
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18K19147
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
松島 綾美 九州大学, 理学研究院, 准教授 (60404050)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 発現制御 / 生体分子 / 生理活性 / 分子認識 / 構造活性相関 / 受容体化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パーキンソン病は、脳内のドパミン不足により生じる疾患の１つである。しかし、対症療法としてドパミンを補うための薬しか存在せず、現在でも根治につながるような治療薬は見つかっていない。このドパミンを放出するニューロンの分化を促すのが、ヒト核内受容体Nuclear receptor related 1 (Nurr1)である。Nurr1は、脳神経系に特異的に発現する核内受容体として知られている。申請者は、最近、レポーター遺伝子試験により核内受容体Nurr1の転写活性を変化させる化合物があることに気付いた。本研究課題では、将来的にNurr1リガンドを用いた、Nurr1の活性制御によりドパミンニューロンを新生するという新規分子メカニズムに基づくパーキンソン病を根治するための治療薬開発に挑む。
初年度である本年度は、Nurr1の活性を指標としたスクリーニングを実施して得られた化合物について、神経細胞分化のモデルとして古くから使われるPC12細胞を用いた神経細胞モデルに対する影響の解析を行った。影響の評価法としては、神経突起伸張を比較解析した。その結果、突起伸張を抑制するものが多く、促進するものも少数あった。また、これまでに申請者らは、分解能は低いがNurr1の結晶を得ることに成功していた。そこで、より高分解能が得られる結晶の作製を試みた。しかし、詳細な構造解析に適応できる良い結晶を得るには至らなかった。現在、さらに条件の最適化を行なっている。
今後は、より神経に近い培養細胞を用いて、引き続き神経突起伸張解析を続ける予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
三年計画の初年度である本課題研究は、概ね計画通り順調に進展している。核内受容体の多くは、女性ホルモン・エストロゲン受容体のように内在リガンドが存在する。しかし、Nurr1はリガンドの結合なしではじめから高い転写活性を示す、いわば自発活性化型の核内受容体である。しかも、内在リガンドは見つかっていない。このような核内受容体は、レポーター遺伝子発現システムにおいて、常に遺伝子発現を活性化してしまうため、レポーター遺伝子の安定発現株を用いるスクリーニングは不適切であると考えられる。そこで、Nurr1のみを安定安定発現する細胞株を作製、これを用いて化合物探索を実施し、これまでに約50化合物がNurr1の転写活性を変化させることを見出している。そこで、これらの化合物について、PC12細胞を用いた神経細胞モデルに対する影響の解析を行った。
PC12細胞は、薬剤誘導により神経突起を伸長するため、神経系のモデルとして汎用される細胞株である。影響の評価法としては、神経突起の長さを比較解析した。その結果、突起伸張を抑制するものが多く、促進するものも少数あった。現在、これらの化合物について、さらに詳細に解析を実施している。また、これまでに申請者らは、分解能は低いがNurr1の結晶を得ることに成功していた。そこで、より高分解能が得られる結晶の作製を試みた。しかし、詳細な構造解析に適応できる良い結晶を得るには至らなかった。現在、さらに条件の最適化を行なっている。このように、本計画は順調に推移しており、現在のところ、研究計画遂行上の問題は生じていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、今年度に引き続き、現在得られている化合物について、PC12細胞を用いた神経細胞モデルに対する影響の解析を詳細に行うとともに、より神経に近い状況の再現を目指して、ヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞株を用いた実験を実施する。SH-SY5Y細胞株は、パーキンソン病研究でよく用いられる細胞株であるが、増殖速度が遅く実験に使いにくいため、PC12細胞株の実験後に実施する。実験にあたっては、無駄なく慎重に計画する。いくつか神経突起伸長に影響が見られる化合物を得ており、化合物の濃度依存性の検討などの詳細な実験を行うとともに、これらのメカニズム解明に迫る研究を展開する。これには、数々の因子が考えられるため、適切な作業仮説を打ち立て実験を実施する予定である。
さらに、影響が見られる化合物については、直接Nurr1に結合するのか、細胞内に存在する何らかの介在因子を介してNurr1に作用するのかを調べるために、生体分子相互作用解析に用いられるBiacoreおよび等温滴定型カロリメトリ（iTC）を用いた実験を計画し、実施する。これらの実験では、細胞を用いないため、単独での相互作用が比較解析できる。こうして直接の結合が期待されると考えられた化合物については、結晶作製の際に添加することにより、分解能を上げることができるか、検討する。こうした実験により、将来的にパーキンソン病治療薬の創製に貢献できる。
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| Causes of Carryover |
本年度の計画は順調に推移している。レポーター遺伝子試験で高額な基質が必要であるが、実験計画を適正に実施した結果、想定以上にスムースに結果を得ることに成功し、それらの使用量がわずかであるが予定よりも少ない量で良い実験結果が得られた。そのため、次年度の使用額が生じた。これは、有効に次年度の試薬購入に使用される。また、Nurr1のみを安定発現する細胞株を作製、これを用いて化合物探索を実施し、これまでに約50化合物がNurr1の転写活性を変化させることを見出している。さらに、今回新たな化合物を複数購入予定であったが、納入に時間がかかり、次年度の支払いが必要であり次年度使用額が生じた。
このように、次年度使用額が生じた理由は適切であり、化合物の入手に時間が必要となっているものの、全体計画としては研究進展にもいかなる問題も生じていない。全ての予算は適切に使用されており、全く問題はない。
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