2019 Fiscal Year Research-status Report
Rational design of artificial radical enzymes bearing unusual protein-derived cofactor
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18K19151
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
藤枝 伸宇 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (00452318)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | Protein-derived cofactor / 翻訳後化学修飾 / キノプロテイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、種々の酵素やタンパク質分子内で、従来の翻訳後修飾(リン酸化等)の枠組みを超える化学的に高度な修飾を受けたアミノ 酸側鎖が相次いで発見されてきた。中でも芳香族アミノ酸から生じる特殊な側鎖は配位子や補欠分子族(Protein-derived cofactor (PDC))として機能中枢を司るものが多く、その機能は多岐にわたる。TyrやTrpから派生したPDCはキノン型の求電子的な性質を始めとし、他の有機補因子にはない物理化学・触媒化学的に稀有な性質を示すことが分かっている。昨年度、本研究では従来の酵素で達成できない化学反応触媒を志向したCPDCを補因子とする高活性なラジカル酵素の創出に挑戦する。
昨年度、小さな分子量を持つキュピンタンパク質を土台とし様々な位置に導入したチロシンとシステイン間の架橋形成が可能であることを示した。最も架橋形成が進行する変異体では、さらに、結晶を還元剤で処理することによって、さらなる酸化反応が進行することを確認し、新規PDCの形成を確認するとともに、この手法の有用性を明らかとした。さらにそれで形成される補因子はキノン骨格をもつ可能性も提示した。そこで本研究ではこのキノン補因子の形成を結晶構造解析によって確認し、さらに、この補因子が形成される条件を最適化した。現状ではタンパク質結晶中でのみ生じるが結晶化剤の種類をポリエチレングリコール系からJeffamine系に変更することによってはっきりとその形成を確認することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者らはProtein Databaseから小型(10kDa)で金属結合部位があり、かつ基質結合場を備えたいくつかの土台タンパク質候補の中から、double stranded β-helixモチーフを持つキュピンファミリータンパク質を用いてきた。3つのヒスチジンからなる金属結合部位に鉄や銅を接合し、Tyrを結合部位から距離を変えて変異導入した。そのうちのI60Y変異体ではTyr-Cys結合を形成し、さらに、jeffamine存在下で結晶をヒドロキシルアミンで処理することによって、さらに酸化させることに成功し、天然では見られたことのないCPDC構築に成功した。占有率の精密化を進めた結果、約7割キノン補因子が形成されていることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに、結晶構造解析では余分な電子密度が観測されており、システイニルチロシルキノンの形成が観測された。さらなる条件検討により、定量的に形成される条件を検索するとともに、溶液状態でもこの新規PDCの形成を達成する計画である。また、このキノンへの求核付加反応を狙い、近傍にCys, His (Lys, Tyr)などの求核性アミノ酸を導入した変異体を作製し、架橋構造形成の有無を確認する。並行して、システイニルチロシルキノンのUV-vis, ESR, ラマン共鳴等の分光測定を行い、諸特性評価を進め、天然での存在可能性について議論する予定である。
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| Causes of Carryover |
研究成果としてキノン補因子が観測され、ほぼ計画通りの進行状況であるが、その反応中間体および分光学的特性が観測可能であるという新たな事実が判明し、その詳細な機構を明らかにすることはこのプロジェクトのより精緻な達成につながる。このように論文として発表するにはさらなる追加実験と論文準備が必要となったため次年度の使用額が生じた。
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