2019 Fiscal Year Annual Research Report
Gene delivery system among bacterial cells by membrane vehicle
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18K19168
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野尻 秀昭 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (90272468)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田代 陽介 静岡大学, 工学部, 講師 (30589528)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 膜小胞 / 遺伝子の水平伝播 / 遺伝子組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜小胞は全ての微生物が分泌するとされる直径20-200 nmの細胞外小胞で、内部にはDNA、タンパク質、情報伝達物質などが包含されており、他細胞に融合することで情報伝達ツールとして機能していると考えられる。しかし、膜小胞の生成・分泌過程に比べて、融合過程についての基礎的な研究が不足している。
本研究では、膜小胞融合能を評価して融合に関する基礎的データを蓄積するとともに、ベクターに載せた外来遺伝子の導入・発現が可能かを評価することを目的としている。2018年度において、膜小胞形成菌として採用した大腸菌にグリシン処理を行うと、膜小胞生産性や膜小胞を含む培養上清中のDNA濃度が増加することを示した。また、大腸菌由来膜小胞にGFPを効率よく封入する方法を確立していた。
2019年度は、これに引き続き、グリシン添加による生育への影響を精査した。対数増殖期の細胞をLIVE/DEAD標識して解析したところ、30％ほどの細胞が死菌となるか細胞膜損傷を受けていることが示された。また、培養の過程で定常期初期に濁度の低下が認められたが、位相差顕微鏡での観察の結果、溶菌が増加していることが示された。また、グリシン処理誘導性膜小胞を、透過型電子顕微鏡法と急速凍結レプリカ電子顕微鏡法により観察したところ、グリシン処理は細胞膜損傷を引き起こし、DNAの漏出や外膜－内膜小胞の形成によって細胞内のプラスミドDNAが膜小胞に封入されると考えられた。
また、外膜タンパク質OmpWや細胞質タンパク質LacAとの融合タンパク質としてGFPを大腸菌内で発現させ、グリシン処理により作成したGFP含有膜小胞を用いて多種多様なモデル最近との相互作用をフローサイトメーターで検出した。その結果、多くの細菌にGFP含有膜小胞が結合することが観察され、グリシン誘導性膜小胞の遺伝子伝播媒体としてのポテンシャルがあることが示された。
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