2019 Fiscal Year Research-status Report
Cellular membrane engineering of Escherichia coli using membrane lipids from hyperthermophilic archaea
| Project/Area Number |
18K19170
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
邊見 久 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (60302189)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
|
| Keywords | 古細菌 / 膜エンジニアリング / 大腸菌 / イソプレノイド / メバロン酸経路 / 膜脂質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
超好熱性古細菌Aeropyrum pernix特異的なC25古細菌膜脂質の大腸菌における生産システムをより高機能化するため、発現プラスミドをpETベクターシステムを用いて再構築した。その結果、大腸菌における各生合成酵素の活性が向上し、後述するイソプレノイド生合成前駆体供給経路との共存によって古細菌膜脂質の生産量を大幅に向上させるための基盤が構築できた。また、C25よりも炭素鎖長の長いイソプレノイド鎖を持つ古細菌膜脂質を、古細菌と真正細菌の遺伝子を組み合わせて導入することにより、大腸菌に合成させることに成功している。これらの非天然型脂質はより厚い脂質二重膜を構成することで、A. pernixのものよりもさらに透過性の低い安定な生体膜を構築できる可能性がある。
さらに、A. pernixの研究により我々が見出した古細菌型メバロン酸経路を大腸菌の細胞膜エンジニアリングに応用するため、常温性古細菌であるMethanosarcina mazeiより同経路を構成する遺伝子を単離し、大腸菌に導入した。古細菌型経路は、既知のメバロン酸経路とは異なる中間体を経る変形経路であるため、既知経路と比較してATPの消費量が少なくて済み、古細菌膜脂質を含むイソプレノイド化合物全般の生物生産を行う上で有益な可能性が高い。実際に同経路を導入した大腸菌におけるカロテノイド色素生産を指標として、そのイソプレノイド生産向上効果を確認したところ、嫌気条件での培養で強い効果が確認できた。現在、同経路を古細菌膜脂質の生産に応用することで、大腸菌の細胞膜エンジニアリングを進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
古細菌型メバロン酸経路の発見は予想外であった。ATP低消費型であり、イソプレノイド生産における有用性が大きく期待できる同経路の応用を図るべく、まずはA. pernix、ついでM. mazeiという古細菌由来の遺伝子を導入することで、同経路の大腸菌における再構築を目指した。古細菌膜脂質に比べて定量が容易なカロテノイド色素を指標として、古細菌型メバロン酸経路の機能評価を進め、論文投稿を行なったが、要求された再実験を行うのに時間がかかってしまった。そのため、補助事業期間の延長を申請した。一方で、古細菌膜脂質生合成システムの高機能化は着実に進んでおり、研究自体は順調に進展していると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
古細菌型メバロン酸経路の大腸菌における発現をさらに強化、最適化するとともに、古細菌膜脂質の生産に対するその適用を試みる。具体的には、pETベクターシステムを使って構築したプラスミドをメバロン酸経路、もしくはメチルエリスリトールリン酸経路といった前駆体供給経路を強化した大腸菌に導入する。大腸菌における古細菌膜脂質の生産向上が達成された場合、まずはその定量に取り組む。その後、同菌の膜そのものの物性を評価し、また、大腸菌細胞の表現系に与える影響を調べる。古細菌膜脂質についてはC20、C25、およびより長鎖のイソプレノイド鎖を持つものなど、複数の脂質の生産系が構築済みであるので、可能であればそれらの比較も行いたい。
|
| Causes of Carryover |
我々は古細菌型メバロン酸経路という、原理的に既知経路よりもエネルギー効率の高い代謝経路を発見することで、同経路の利用によって大腸菌における古細菌膜脂質の大量生産を達成できると考えた。そこで、まずはイソプレノイド全般の生産向上を確認すべく、カロテノイド色素を指標とした実験を行い、論文を投稿した。しかし、その際に要求された再実験に時間を要し、目的とする超好熱性古細菌膜脂質の生産についての実験に遅れが出てしまった。そのため次年度使用額が生じ、それに応じて研究期間を延長した。
使用計画としては、主に実験用の試薬、培地など消耗品の購入を予定している。
|
Research Products
(17 results)
