2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K19179
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
丸田 隆典 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (50607439)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 貴央 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (80603802)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | ビタミンC / アスコルビン酸 / デヒドロアスコルビン酸 / システイン酸化 / チオレドキシン / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンCの生理活性を最大限に発揮するためには、酸化型（デヒドロアスコルビン酸、DHA）から還元型への再生系が不可欠である。植物ではグルタチオン依存のDHA還元酵素（DHAR）が古くに同定され、再生系の鍵酵素であると信じられてきた。しかし最近、DHARのビタミンC再生への寄与は小さいことがわかり、未同定のDHA還元系の存在が示唆された。そこで本研究では、1）ファンクショナルプロテオミクスによる新規DHARの同定、2）既知の再生酵素（DHARおよびモノデヒドロアスコルビン酸還元酵素[MDAR]）の貢献度の明確化を目標とした。1）に関しては、DHAがタンパク質システインの酸化剤として作用する点に注目し、DHAによってシステイン酸化を受けるタンパク質の中に新規DHARが含まれると考えた。そこで、DYn-2プローブを用いたDHA依存的システイン酸化タンパク質の同定を試みた。シロイヌナズナ培養細胞を用いて、DHA外部処理のタンパク質酸化への影響を調べたが、DHA依存的なタンパク質酸化は検出されなかった。既知のDHARによる相補の可能性を考え、グルタチオン生合成阻害剤処理を事前に施した後、同様の実験を行なったところ、DHA処理によるシステイン酸化の亢進が認められた。このことから、タンパク質システインを介した新規DHARは存在することが確かめられ、既知DHARと相補的に機能することが示された。現在、質量分析により酸化タンパク質の実態解明に取り組んでいる。2）に関しては、シロイヌナズナに存在するDHAR（3遺伝子）およびMDAR（5遺伝子）に加え、チオレドキシン還元酵素やグルタチオン合成酵素などの多重変異株を作出した。DHAR三重欠損株に、さらにグルタチオン欠乏変異を導入したところ、ストレス条件におけるビタミンCの増加が顕著に抑えられることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DYn-2プローブを用いたアッセイにより、DHA依存的なタンパク質システインの酸化がグルタチオン欠乏下において亢進されることを明らかにできた。グルタチオンはDHAや酸化システインの還元に関与するため、DHA依存的なシステイン酸化を妨害していたと考えられる。このために実験条件の設定に時間を要したが、現在進めている質量分析により、新規DHAR候補の単離が現実的になったと言える。また、チオレドキシン還元酵素と既知のDHARを全て破壊した五重変異株の作出に成功し、新規および既知DHARの相補的な役割について遺伝学的に調べる基盤が整った。さらに、多重変異株を用いた解析により、既知DHARの貢献度を明確化することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在進めている質量分析により、新規DHAR候補タンパク質を同定し次第、リコンビナント酵素を作出し、in vitroにおけるDHA還元能力を評価する。同時に、チオレドキシン還元酵素の破壊株やDHAR欠損株との多重変異株を用いた解析により、新規経路の生理学的重要性を遺伝学的に証明する。また、既知の酵素、特にMDARの機能を解明するための遺伝学的ツールが整ったため、その重要性の解明に取り組む。
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| Causes of Carryover |
質量分析装置の不具合のため、2018年度に実施予定だった計画を一部実行できなかったため。
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