2019 Fiscal Year Research-status Report
Synthetic chemistry-genetic engineering technology enabling the modification of antibody protein functions
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18K19182
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
西形 孝司 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (90584227)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星田 尚司 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (00314823)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | タンパク質 / アミノ酸 / tRNA / アミノ化反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
有機合成化学と遺伝子工学的アプローチの２通りから報告する。
有機合成化学：人工設計した抗体タンパク合成には，1)非天然アミノ酸の新規合成法開発と2)非天然アミノ酸のtRNAへ組み込む方法を開発する必要がある．非天然アミノ酸の合成法は、銅触媒または塩基条件下によるカルボン酸誘導体であるαブロモカルボニル化合物とのアミノ化カップリング法をこれまでに見出してきた．本年は、金属触媒非存在下での非天然アミノ酸合成プロセスの確認を昨年に引き続き行った。αブロモカルボニル化合物を炭酸セシウム存在下アルキルアミンとの反応を試みたところ、アセトニトリル中室温にて対応するアミノ化生成物を確認することができた。さらに，キラルαブロモカルボニル化合物をアニリンと同条件下で反応させたところ，基質の立体を保持した生成物を得ることができた．しかし，保持率は70%程度と中程度にとどまっており，さらなる反応条件の改善が必要である．また、アミンの代わりにアルコールをキラルαブロモカルボニル化合物と反応させたところ，アミノ化反応とは異な最高で98%のキラル保持率で反応が進行した．得られた生成物はエーテル体であるがこの知見をアミノ化反応へと展開することで今後キラル非天然アミノ酸合成へと展開できると期待している．反応機構を明らかにし、合成した非天然アミノ酸のtRNAへの組み込みを目指す。
遺伝子工学：緑色蛍光タンパク質GFPに結合する新たなNanobodyを用いて，これまでと同様の手法で抗原認識に重要なアミノ酸配列を解析した。また，抗原側の結合部位が報告されている別のNanobodyおよびその抗原タンパク質を用いた解析を行った。それぞれの変異解析およびこれまでの変異解析から，結合を変化させる類似の変異が見つかった。非天然アミノ酸を導入する準備としてin vitro翻訳システムによるNanobody合成を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の目標の一つはキラル非天然アミノ酸を合成することである．有機合成化学的には、アミノ酸を金属触媒なしで合成できるプロセスの開発を見出すことができた。しかし，キラルαブロモカルボニル化合物と反応させたところ，キラリティーの保持率は7割前後と高いものではなかった．99%の保持率を目指す必要がある．一方で、遺伝子工学的研究は次の知見を得た。 新たなGFP結合性Nanobodyの抗原結合部位のうち，CDR1とCDR2を構成するアミノ酸残基23カ所をアラニンに置換した。先に行った別のNanobodyと同じ，31番目および57番目の変異で結合能が低下した。さらに別のタンパク質に結合能を示すNanobodyを合成し，抗原タンパク質とGFPを融合させたところ，細胞内で共局在した。そこで，このNanobodyでも変異解析を行ったところ，56番目の変異で結合能が低下したことから，この位置のアミノ酸残基が，普遍的に結合に重要性であることが示唆された。そのため、上記のように判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
有機合成化学：本年度見出した，キラルαブロモカルボニルとアミンとの立体保持型求核置換反応の効率を99%にできるようにすることが今後の目標である．この反応をアミン求核剤からアルコール求核剤に変えると保持率は98%にまで向上したことから，原理的にはアミンとの反応においても高い保持率で進行すると期待している．このためには，一連の反応のさらなる理解とデータ収集が必要である．金属触媒非存在下でアミノ酸を合成可能な反応を開発すること、そして、tRNAへの組み込み検討を行うことを今後、検討予定である。そのために、前回発見した電子反応系プロセスを反応機構を含めて確認することで、新たな知見獲得を目指す。合成を目指す抗体タンパクへの金属残渣を防ぐためにも、本問題の解決は喫緊である。
遺伝子工学：新たに合成したNanobodyは抗原との相互作用部位が報告されている。この情報をもとに，抗原側の変異の影響，および抗体側と抗原側の両法の変異の組合せの効果を解析し，抗原抗体反応における，アミノ酸間の相互作用を解析する。これらの情報をもとに非天然アミノ酸導入を検討する。一方，in vitro翻訳系での合成に課題があり最適化が必要である。
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| Causes of Carryover |
最終年度に研究のとりまとめを行う。そのため、費用の後ろ倒しを行った。
そのため2020年度に、必要試薬の購入や学会発表などの費用として用いる。
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Research Products
(4 results)
