2019 Fiscal Year Research-status Report
Generation of super thraustochytrids specialized for lipid production
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18K19183
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
沖野 望 九州大学, 農学研究院, 准教授 (90363324)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石橋 洋平 九州大学, 農学研究院, 助教 (90572868)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | スラウストキトリッド / 脂質生産 / 中性脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脂質生産に特化したスラウストキトリッドのスーパーアスリート株の選抜と遺伝子変異株の解析により、新規な脂質蓄積に関わる遺伝子を網羅的に探索すること、並びに、脂質生産の増強に関わる遺伝子変異株を機能性食品やバイオ燃料の生産に使用するために必要なゲノム編集をスラウストキトリッドに適用するための技術開発を合わせて実施している。
スラウストキトリッドの選抜育種による脂質生産強化株の取得に関しては、培養液を遠心した後の上清の継代を繰り返すことで、遠心しても沈みにくくなる株を樹立している。本株の脂質を分析したところ、野生株と比較して細胞内のトリアシルグリセロール量が有意に増加していることが分かった。これらのことは、本方法により、中性脂質含量が増加したスラウストキトリッド株（スーパーアスリート株）の樹立に成功したことを示している。本年度は、スーパーアスリート株と野生株の遺伝子発現量の解析により、脂質増産に関与する遺伝子の特定を進めた。
外来遺伝子の導入による脂質生産に関わる新規遺伝子の探索に関しては、スラウストキトリッドにネオマイシン耐性遺伝子を導入することで、ランダムに遺伝子が破壊された株のライブラリーを作成している。本年度は、遺伝子導入の効率が低いことから遺伝子導入条件の見直しを行い、最適化した条件で作成した遺伝子破壊株ライブラリーに対して、引き続きスクリーニングを進めた。
ゲノム編集による遺伝子操作法の確立に関しては、これまでにスラウストキトリッドでCRISPR/Cas9システムを使用してゲノム編集を行うためのシステムを構築していた。本年度はスラウストキトリッドのグルクロニダーゼ発現株を樹立し、本株に対してゲノム編集を行うことでゲノム編集が成功したことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究において、スラウストキトリッドの選抜育種により、野生株に比べて脂質生産が強化された株（スーパーアスリート株）の取得に成功している。本年度は脂質生産に関与する新たな因子を同定するために、野生株とスーパーアスリート株から抽出したRNAの発現量解析を進めることで、脂質生産に関与する因子を探索した。また、外来遺伝子の導入による脂質生産に関わる新規遺伝子の探索に関しては、スクリーニングの効率を上げるために、遺伝子導入条件を最適化し、スクリーニングを継続した。一方、これまでに取得していた脂質生産変異株の遺伝子解析を行うことで、当該株ではミトコンドリアの電子伝達に関与するタンパク質に変異が起こっていることを明らかにすると共に、詳細な解析を進めることで、当該株で脂質合成不全が起こっている原因の一端を明らかにすることが出来た。
スラウストキトリッドにおけるゲノム編集技術の確立に関しては、昨年度までにスラウストキトリッドでCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行うためのシステムを立ち上げていたが、形質転換の効率が非常に低いために実際にゲノム編集には成功していなかった。そこで、発色基質を用いてコロニーレベルでスクリーニングを行うために、スラウストキトリッド（A. limacinum）のグルクロニダーゼ発現株を作成し、グルクロニダーゼ遺伝子に対してゲノム編集を試みた。その結果、グルクロニダーゼ遺伝子に対するゲノム編集に成功したことが確認出来た。
以上のことから研究はおおむね順調に進んでいると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究において取得した脂質生産が強化されたスーパーアスリート株と野生株の遺伝子発現解析の結果を精査することで、新規な脂質蓄積に関わる遺伝子を同定し、その遺伝子の過剰発現株の作成や欠損株の作成により、新たに同定した遺伝子の脂質生産における役割を明らかにする。また、外来遺伝子の導入による脂質生産に関わる新規遺伝子の探索に関しては、遺伝子導入条件の見直しにより、形質転換の効率を上げることが出来たので、セルソーターを用いて、スクリーニングを進めると共に、取得した株における原因遺伝子の同定を行うことで、脂質蓄積に関与する遺伝子を特定する。
ゲノム編集に関しては、スラウストキトリッドの一種であるA. limacinumにCRISPR/Cas9システムを適用することで、ゲノム編集に成功したが、依然として効率が低いので、ゲノム編集の効率を高める為にCas9複合体の導入条件を最適化すると共に、脂質生産に関わる幾つかの遺伝子に対してもCRISPR/Cas9によるゲノム編集を試みる。また、他のスラウストキトリッドに関してもゲノム編集を適用するために、実験条件（遺伝子導入条件）の最適化を試みる。
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| Causes of Carryover |
遺伝子導入条件の再検討が必要になったことから、スクリーニングによる変異株の取得に時間が必要となり、研究期間の延長と次年度の使用額が生じたが、繰り越し分は予定通り、全て使用できると考えている。
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