Improvement in a E. coli host cell for DNA cloning of long DNA fragments.

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19193
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 仁木 宏典 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 教授 (70208122)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: 形質転換体 / オメガ因子 / RNAポリメラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

シームレスクローニングと呼ばれる制限酵素による切断を必要としないDNAクローニングが普及し始めている。この方法は、市販の酵素・試薬キットなどを使用せずとも大腸菌細胞内に直にDNAを形質転換するだけでクローニングを可能とする。この廉価かつ簡便な細胞内でのシームレスクローニングを高効率で行わせるため、高形質転換効率-高インビボ組換え活性を持ったこれまでにない高機能宿主大腸菌株の開発を目指す。そのため形質転換効率の分子メカニズムを解明を試みてきた。大腸菌の網羅的遺伝子破壊変異ライブラリーを使い、高形質転換効率-高インビボ組換え活性に関連する遺伝子の探索を行った。その結果、形質転換効率を向上させる変異の遺伝子の候補としてrpoZ遺伝子を見出し、その形質転換効率の向上の機構についてさらに研究を進めた。rpoZ遺伝子はRNAポリメラーゼの構成因子であり、多くの遺伝子がその発現制御を受けている。したがって、RNAポリメラーゼの制御下にある遺伝子の中に形質転換効率に影響するものがあると考えた。事実、欠失染色体領域コレクションを使ったスクリーニングの結果、69遺伝子の中に原因遺伝子があると推定され、その特定を試みた。しかし、最終的には遺伝子の特定には至らなかった。再度の検証の結果、実際は複数の遺伝子が相加的に影響しているものと考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

欠失染色体領域変異株MGFコレクションは、16段階の遺伝子欠損を経て作成され、最終的には１Mbpの染色体領域を欠失している。そのため、およそ２５％の遺伝子を欠失している。この欠失染色体変異株を使って、rpoZ遺伝子の影響下にあり形質転換体の効率に影響する遺伝子の特定を進めた。第6段階の欠失変異株からrpoZ遺伝子の欠損による形質転換効率の向上が失われていたことから、この段階で欠失された領域に含まれる69遺伝子の中に原因遺伝子があると推定し、この領域の個々の遺伝子破壊変異株を使って原因遺伝子の特定を試みていた。しかし、ながら特定の遺伝子にたどり着くことはできず、欠失染色体領域変異株と使ったスクリーニングの再検証をおこなった結果、rpoZによる形質転換効率の上昇は複数の遺伝子が関与している可能性が出てきた。そして、それらの遺伝子は第1段階から第6段階で欠失された領域の中にあると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

rpoZ遺伝子に関連して、形質転換効率に影響する遺伝子の特定には至らなかったが、形質転換効率が向上した宿主株の作成は進展している。また、別の遺伝子で形質転換効率の向上に関係するものが見つかっており、その解析を進め、rpoZ遺伝子との相加的な効果を検証する。特に外膜タンパク質に関連する遺伝子について研究を進める。形質転換効率が向上するのではなく、逆に形質転換効率が大幅に低下する遺伝子欠失が得られており、それが複数の大腸菌の外膜の構成因子であるリポ多糖 (LPS) の合成に関わる遺伝子欠失であった。外膜タンパク質は直接、DNAを取り込むときに影響しているはずであり、これらの遺伝子の発現状態は形質転換効率に強く影響すると考えられる。

Causes of Carryover

前年度の実験の再検証を行うなどし、年度内の研究の大半はこれまでの研究の再現性の確認であった。そのため本年度計画を次年度に行うこととし、次年度使用額についてはその計画を遂行するために使用する。