Development of aptamer recognizing native higher molecular structures of viroid – circular single-stranded RNA pathogen

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19196
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: アプタマー / ウイロイド / 診断薬 / 防除薬 / SELEX法 / アンプリコン解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究の代表者と海外協力研究者Kaponi Maria博士（ギリシャ）が諸条件の最適化を行ってきたウイロイドを標的とする核酸アプタマーの選抜方法、すなわち、SELEX法の基本的プロトコール（未発表）により、人工合成したランダムな20塩基、30塩基、及び40塩基のssDNAライブラリーから、ジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）を標的とする核酸アプタマー候補ssDNA集団を選抜・濃縮し、次世代シークエンサーによるアンプリコン解析を実施した。その結果、まず、ランダムな20塩基のssDNAライブラリーからは特定の配列が濃縮されなかったが、ランダムな30塩基及び40塩基のssDNAライブラリーからはそれぞれ3種類と1種類の特定の配列が濃縮されたことが明らかになった。最も高頻度に検出された配列はランダムな30塩基のssDNAライブラリーから選抜・濃縮されたもので、次世代シークエンス解析で得られた全リード数（約1000万リード）の約0.33％を占めていた。同様に、30塩基のssDNAライブラリーから選抜・濃縮された2番目に多い配列は約0.28%、3番目は約0.04%、40塩基のssDNAライブラリーから選抜・濃縮されたものは約0.03%であった。4種類いずれの配列も標的としたPSTVdと塩基配列の高い相同性は見られなかった。以上の結果から、報告者らが諸条件の最適化を検討してきたウイロイドを標的とする核酸アプタマー選抜方法で、ランダムな30 ～40塩基のssDNAライブラリーから特定の配列の選抜・濃縮が可能なこと、また、SELEX法で選抜したssDNA集団の次世代シークエンサーによるアンプリコン解析により、選抜・濃縮された特定の配列を効率的に判定できることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の検討により、これまで反応諸条件を検討し最適化をはかってきたSELEX法がウイロイドを標的とするアプタマー選抜法として利用可能なことが確認できた。また、SELEX反応後の集団を次世代シークエンサーによるアンプリコン解析をすることにより、集団中に低頻度で存在する有意に濃縮された特定の配列集団を効果的に検出できることがわかった。すなわち、SELEX法と次世代シーケンサーによるアンプリコン解析を組み合わせることで、今後、ウイロイドと特異的に結合するアプタマーを効果的に選抜する技術を確立することができた。

Strategy for Future Research Activity

初年度に有効性を確認したウイロイドを標的とするアプタマー選抜のためのSELEX法を引き続き繰り返し、得られたウイロイドを標的とする核酸アプタマー候補ssDNA集団の多様性と特定のssDNA配列の濃縮程度を次世代シークエンサーによるアンプリコン解析で分析し（海外研究協力者Kaponi博士を招へいして共同実験）、多様な配列を有するアプタマー候補配列を収集する。
また、初年度に選抜した3種類の30塩基のアプタマー候補配列及び1種類の40塩基のアプタマー候補配列を人工合成し、標的ウイロイドとの特異的結合能を分析し、より特異的結合能の高い配列を評価選抜するシステムを構築する。

Causes of Carryover

ウイロイドを標的とするアプタマー選抜のためのSELEX法を実施し、次世代シークエンサーによるアンプリコン解析を外部委託する予定であったが、研究代表者と海外研究協力者が独自にフリーの解析ソフトを駆使してアンプリコン解析データを分析することができたため、その分の経費がかからなかった。また、今年度使用しなかった分は次年度に集中して使用し、海外研究協力者を招聘して共同研究と論文執筆の準備をすすめることを予定している。