2018 Fiscal Year Research-status Report
Optogenetics-based approach for understanding postembryonic development in insects
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18K19213
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大出 高弘 京都大学, 農学研究科, 助教 (60742111)
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2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 後胚発生 / 不完全変態昆虫 / 光遺伝学 / ゲノム編集 / メラニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
不完全変態昆虫は、孵化した時点で基本的な形態部品が形成されており、翅に代表されるように、ある部位のみが孵化後（後胚期）に著しい成長・分化を示す。本研究ではこの特徴を生かし、不完全変態昆虫フタホシコオロギの後胚発生をモデルとすることで、昆虫の脱皮に伴う形態変化の時空間的な制御機構解明を目的としている。
この目的にあたり、まずフタホシコオロギにおける光遺伝学を利用した時期組織特異的な遺伝子発現制御系の構築を目指している。本年度は、青色光依存的な転写活性化タンパク質の標的配列である10xUASあるいは5xC120と、レポーター遺伝子であるEGFP配列を結合したDNA配列をユビキタスプロモーターであるGbactプロモーターの制御下に配した遺伝子カセットの、フタホシコオロギゲノムへの導入を試みた。
黒く着色したフタホシコオロギの体表は、外部からの蛍光シグナル観察の妨げになる。昆虫の黒色着色はクチクラ中に存在するメラニンによる。メラニン合成経路に関与する酵素は様々な昆虫において明らかになっている。そこで、フタホシコオロギゲノム中のメラニン合成系酵素をコードする遺伝子群を同定し、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いてそれらの遺伝子配列中に遺伝子カセットの導入を試みた。これにより、メラニンによる着色の阻害と、遺伝子カセットの導入が同時に達成できる。
CRISPR/Cas9によって、一部のメラニン合成系酵素をコードする遺伝子が破壊されると、黒色の着色が阻害されることから、フタホシコオロギにおいても他の昆虫と類似したメラニン合成経路が保存されていることが明らかとなった。一方で、フタホシコオロギで既に有効性が確認されている非末端相同結合を利用した外来遺伝子の導入法では、遺伝子カセットの標的ゲノム領域への導入は確認されておらず、現在のところゲノム編集系統の確立には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画においては、初年度に光遺伝学を利用した時期組織特異的な遺伝子発現制御系を確立し、二年目に後胚期において顕著な形態変化を示す翅などの部位におけるホルモン応答性遺伝子の局所的な機能解析を行う計画であった。しかし、ゲノム編集系統の作出の遅れにより、光遺伝学手法の確立に当初の計画より遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. ゲノム編集を利用した外来遺伝子の導入方法として、非相同末端結合を利用した方法以外に、相同組換えを利用した方法を利用する。
2. CRISPR/Cas9を利用してメラニン合成経路遺伝子のノックアウトコオロギ系統を作出した上で、遺伝子カセットはトランスポゾンを利用してゲノム中のランダムな場所に挿入する。トランスポゾンを利用した遺伝子組換では、CRISPR/Cas9を利用したゲノム編集のようなゲノム中の特定の場所を標的とした外来遺伝子導入はできないが、ゲノム中のランダムな場所への導入が可能である。この手法はフタホシコオロギにおいても有効性が確認されている。
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| Causes of Carryover |
フタホシコオロギのゲノム編集系統作出に当初の計画より遅れが生じているため、次のステップである形態解析に必要となる組織学用試薬や分子生物学用試薬を購入するに至らず、次年度使用額が生じた。次年度は、主にゲノム編集系統作出用の分子生物学用試薬および動物実験用試薬や用具の購入、さらに形態解析に用いる組織学用試薬類の購入に助成金を使用する。
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