2019 Fiscal Year Research-status Report
メタゲノム情報からの難培養菌が要求する因子の特定と利用による培養可能化
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18K19221
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤田 雅紀 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (30505251)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | 海綿 / 二次代謝 / 共生細菌 / 海洋天然物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
共生様式の解明 ミカーレ属海綿から得た細菌懸濁液に対して抗腫瘍抗生物質マイカロライド類の生合成遺伝子配列をターゲットとしたFISH解析を行う事により、染色条件の確立と特異的に染色される細菌細胞を見出していた。今年度は海綿の各ライフステージにおける共生様式を確認するため、組織切片を用いたFISHを試みた。海綿成体、胚、および放出直後の幼生を採取し直ちに固定後、パラフィン包埋して切片を作成した。前年度確立した染色条件によりハイブリダイズしたところ、胚および幼生内に特異的に染まる細菌塊が多数確認された。細菌塊の中央には海綿細胞核が存在する事から、これは細菌を特異的に共生させる細胞であるbacteriocyteであると考えられた。また、bacteriocyteと考えられる細菌塊は胚の段階で組織内に点在する事から、マイカロライド生産菌はbacteriocyteに共生する形で垂直伝播する事が予想された。また、bacteriocyte様の細胞には特異的に染色される細菌以外の菌は見られない事、また組織内にも他の細菌は少ない事から、選択的な垂直伝播が起きていると考えられた。
メタゲノム解析 マイカロライド共生菌メタゲノムのロングリードおよびショートリード解析結果をハイブリッドアセンブルする事で、約2.53Mbの完全長環状DNA配列を決定した。さらにショートリードをマッピングし、手動でミスアセンブルを除去していく事で、非常に精度の高いゲノム配列を完成し、詳細な機能解析を可能とした。その結果、本細菌は繰り返し配列が高頻度で含まれており、ゲノムも一般的な自由生活細菌と比較して縮小している事、複数の大型生合成遺伝子クラスターを有する事などが明らかになった。これらの事は、本細菌がミカーレ属海綿と極めて密接な共生関係を築きつつある途上であり、ゲノムの再構築が進んでいる状態であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
共生様式の解明 本年度の検討結果からマイカロライド生産菌はbactriocyteという細菌を共生させるための特別な細胞に細胞内共生して垂直伝播されている可能性が強く示唆された。これは共生様式の解明のための大きな進展であり、このbacteriocyteを分離し遺伝子発現等の性状を解析する事で、どの様に共生が確立されるのかを明らかにする足掛かりを提供するものである。また、ミカーレ属海綿ライフサイクルの解析から、熊本県天草諸島においては初夏に幼生が放出され直ちに着底した後、11月くらいまではほとんど成長しない事、12月に入り一気にサイズの拡大があり、3月以降胚が発達する事が明らかになった。今後、胚発生の初期から後期までを観察する事で、bacteriocyte形成過程の解明が可能となる。また、bacteriocyteという特異な細胞がどの様に共生細菌を選択的に取り込み、維持しているのかは全く明らかになっていないが、トランスクリプトーム解析を行う事で、その詳細に踏み込むことが可能になった。
メタゲノム解析 本年度はミカーレ属海綿共生細菌メタゲノムのロングリード解析を複数回行い、またショートリードとのハイブリッドアセンブルを複数のアセンブラーを用いて検討したところ、環状化するまでアセンブルできた。さらに手動でブラッシュアップする事で、ほぼ完全な配列決定に至り、本格的にゲノムべースでの機能解析を可能とする段階にきた。これで、本細菌の代謝能を網羅的に明らにする事ができ、自由生活できない理由、それを補う方法を合理的に検討する事ができる。また、完全なDNA配列を入手できたことで、メタプロテオミクスによるタンパク質発現解析を行えば、実際の生活環境における生態を解析する事もできる。
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| Strategy for Future Research Activity |
共生様式の解明 ①共生細菌用細胞であるbacteriocyteの形成過程を初冬の海綿の成長段階から胚の発生期間を通じて観察する事で、どの段階でどの様に形成されるのかを明らかにする。形態学的な観察であるが、各ステージでの発生状況を明らかにすることで、次に示すbacteriocyteのトランスクリプトーム解析の指標とする。②bacteriocyteがどの様にマイカロライド生産菌を取り込み、また維持していくのかについては、海綿細胞および細菌細胞の双方のトランスクリプトームあるいはプロテオミクス解析が重要なカギになると考えられる。成熟したbacteriocyteは容易に染色可能であり、またサイズもほぼ均一で大きめの真核細胞サイズであり、さらに中は多くの生産菌が詰まっており、容易にフローサイトメーターによる分離が可能と期待される。また、他の細菌の混入がかなり抑えられると期待される事、また細菌側についてはゲノム情報も完備できたことから、意義のあるトランスクリプトームおよびプロテオームデータが取得可能と考えられる。
メタゲノム解析 共生の確立において宿主側であるbacteriocyteとの化学的相互作用がある事は推測されるが、ミカーレ属共生細菌のメタゲノム解析を行うとどの採取地でもいつの季節でも必ず合わせて検出される、新規性の高いαプロテオバクテリアが存在している。ロングリードおよびショートリードデータにはその共生細菌のデータも含まれているため、今後は常在細菌の全ゲノムデータを明らかにするとともに、指標となる配列を決定し、FISHによる共生様式を明らかにすることで、マイカロライド生産菌との関係解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
次年度使用が生じた状況： 本年度は第三世代型DNAシーケンサーであるOxford Nanopore Technology社のMinIONを複数回用いる予定であった。フローセルは1枚約12万円であり、多くの予算をフローセル代として充てていた。しかし、フローセルの性能が短期間に大幅に向上しており、予定していた解析を２枚のフローセルで行う事ができたため予算の残額が生じた。また、データ解析のためにスーパーコンピューターの利用および業者への委託を予定しており、その利用料と解析料を積算していたがバイオインフォマティクスを専門とする共同研究者の協力でサーバーを無料で利用する事ができ残額が生じた。
次年度使用計画： 本年度の解析で共生細菌の局在が明らかになり、当初予定していなかった共生用細胞のトランスクリプトーム解析を行う予定であり、そこで多くのOxford Nanopore Technology社のMinIONフローセルの消費するため、その予算に充てる計画である。また、やはり当初は予定していなかった電子顕微鏡による共生様式の詳細な解析を予定しており、その利用料やサンプル前処理の外部委託などに充てる予定である。
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Research Products
(1 results)
