2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of cell therapy for renal anemia using canine and feline new stem cells
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18K19273
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (30171143)
森 英樹 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (30450894)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | XEN細胞 / 新規幹細胞 / ネコ / イヌ / エリスロポエチン / iPS細胞 / 胚盤胞期胚 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、iPS細胞よりもやや分化しているが安定して増殖するイヌとネコの新規幹細胞である人工多能性胚体外内胚葉細胞（iXEN細胞）を作製し、これをEPO産生細胞へと分化させることで、慢性腎臓病罹患動物の治療に応用することである。
現在までに以下のような研究成果が出ている。
1. イヌ胎子線維芽細胞に自然に除去される仕組みを持ったセンダイウイルスベクター（SeVdp）を使用して、初期化遺伝子（Oct3/4,Sox2,C-Myc,Klf4）を導入し、遺伝子に傷がつかないイヌiXEN様細胞の作製を試みたところ、iXEN細胞の性質を持つ細胞が作製された。本細胞はSeVdpの発現が消失していたことから、遺伝子組換えの無いイヌiXEN様細胞が作製できた。
2. ネコ胎子線維芽細胞を用いてイヌと同様にiXEN細胞作製を試みたが、細胞を継代することで分化することがわかった。しかしながら、培養条件を変えることでネコiPS様細胞が得られることが分かった。得られたiPS様細胞はSeVdpを発現している細胞と消失している細胞が混在していた。
3. ネコ精巣上体から得られた精子から真空凍結乾燥機を用いてフリーズドライ精子を作製した。このフリーズドライ精子を冷蔵庫で保存した後、ネコ卵巣から得られた未成熟卵子を体外成熟して、顕微授精（ICSI）を行った。その結果、フリーズドライした精子でも、新鮮な精子と同様に胚盤胞期胚を作製できることがわかった。今後、胚盤胞期胚を用いて、正常な発生過程におけるES細胞およびXEN細胞への分化について調べることが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子挿入のないウイルスフリーなイヌiXEN細胞の作製は可能となっている。また、ネコiXEN細胞の作製には至っていないが、その過程でネコiPS様細胞が得られており、まだ世界的に報告のないネコiPS細胞作製への期待が高まっている。さらに、ネコ胚盤胞期胚の作製を安定的にできるようになり、研究は順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まだ、作製できていないネコiXEN細胞の作製を進める。また、研究課程で得られたネコiPS様細胞については、この細胞を用いてEPOへ分化させるという新しい研究展開を進めていく。
さらに、iXEN 細胞の最適な培養条件の検討を行う。サイトカイン、低分子化合物が培養維持に重要であると予想できており、真に必要な因子を明らかにする。また、細胞の生存率や増殖率を上げる細胞の足場である細胞外マトリックスを使用し、簡易で大量にiXEN細胞が培養できる環境を整える。
可能であれば、各種幹細胞をEPO再生細胞へ分化させるための予備実験を開始する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた状況としては、iXEN細胞等の幹細胞の大量培養やEPO産生細胞の作製に必要となる培養用プラスチック製品や、各種のサイトカイン、シグナル活性化因子や阻害因子などの低分子化合物を用いた研究がまだおこなわれなかったことが要因の一つである。これらの試薬は非常に高価であるため、次年度にはこれらの試薬を購入するとともに、EPO分化の確認に必要な抗体も購入する予定である。
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