2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the signaling pathways that induce gene amplification
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18K19281
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中山 啓子 東北大学, 医学系研究科, 教授 (60294972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城田 松之 東北大学, 医学系研究科, 講師 (00549462)
舟山 亮 東北大学, 医学系研究科, 助教 (20452295)
中川 直 東北大学, 医学系研究科, 助教 (30707013)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝子増幅 / TGF-β刺激 / Myc遺伝子 / シグナル伝達経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子の過剰な増幅を誘導するシグナル伝達経路を明らかにすることを目的として本研究を行った。私たちは、TGF-βシグナルの活性化による特異的にかつ再現性を持ったマウス染色体15番上のがん遺伝子myc を含む領域とその近接する領域が遺伝子増幅することを見出している。そこで、このシステムを活用して、遺伝子増幅を誘導するファクターの同定を試みた。
まず、遺伝子増幅を起こすシグナル経路の探索を行った。TGF-β刺激によってどのようなタイムコースで増幅が起こるか探索を行ったところ、刺激開始後２日目ですでに細胞の増殖は停止したが、刺激後７日目でも遺伝子増幅は認められなかったが、28日目には増幅が起こっていた。
TGF-βの下流分子として知られているSMAD2の遺伝子増幅へ関与を検討するために、SMAD2の発現誘導株を作製した。また、遺伝子増幅領域に存在するタンパク質を探索するために、遺伝子増幅領域に特異的に結合する3xFLAG-dCas9を作製し、それに結合するタンパク質の探索した。
増幅した遺伝子の核内局在を調べるためにTGF-β刺激後、時間経過を追って細胞を回収し、FISH (Fluorescent in situ hybridization)によって、この増幅した遺伝子が細胞内のどこに存在するか確認を行った。その結果、増幅遺伝子はタンデムに増幅していることが確認され、該当するゲノム領域に増幅を誘導する配列が存在することが示唆された。
一方、CRISPR-Cas9 ライブラリーシステムを用いて網羅的なゲノムスクリーニングを行い、アポトーシスを指標として遺伝子増幅に必要なシグナル経路の同定を試みた。遺伝子増幅が起こるAbcd2遺伝子領域に Caspase-ER(T2)遺伝子を挿入し、遺伝子増幅するとtamoxifenの培地添加によってアポトーシスが誘導できる細胞の作製を行った。
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[Journal Article] Germline-Activating RRAS2 Mutations Cause Noonan Syndrome2019
Author(s)
Niihori Tetsuya、Nagai Koki、Fujita Atsushi、Ohashi Hirofumi、Okamoto Nobuhiko、Okada Satoshi、Harada Atsuko、Kihara Hirotaka、Arbogast Thomas、Funayama Ryo、Shirota Matsuyuki、Nakayama Keiko、Abe Taiki、Inoue Shin-ichi、Tsai I-Chun、Matsumoto Naomichi、Davis Erica E.、Katsanis Nicholas、Aoki Yoko
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Journal Title
The American Journal of Human Genetics
Volume: 104
Pages: 1233～1240
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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