2019 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of a method for improving the efficiency of stem cell differentiation using a protein knockdown strategy
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18K19282
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
清水 康平 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (70727073)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
犬塚 博之 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (20335863)
福本 敏 九州大学, 歯学研究院, 教授 (30264253)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 再生医療 / 細胞分化 / プロテインノックダウン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
幹細胞を用いた再生医療技術の臨床応用が推進される中、依然として高効率で精度の高い分化誘導法の確立が求められている。本研究では、幹細胞の高効率な分化誘導法確立のための新たなプラットフォームの構築を目的とし、これまでに確立されてきた細胞分化誘導系に、ユビキチン-プロテアソーム系によるネオ基質の特異的タンパク質分解を薬理作用として想定したプロテインノックダウン技術の導入を試みた。特に本研究では、タンパク質分解のメディエーターとしてユビキチン化酵素CRBNに着目し、CRBNのネオ基質リガンドになり得るグルタルイミド基含有化合物を用いて、表現型スクリーニングによる細胞分化評価系の確立を進めてきた。
最終年度は化合物を拡充し、前年度に設定したスクリーニング条件をもとに、骨芽細胞分化及び破骨細胞分化を制御可能な化合物の同定を目指した。骨芽細胞分化はUE7T-13細胞を用いてアルカリフォスファターゼ染色により評価し、破骨細胞分化はRAW264.7細胞を用いてTRAP染色により評価した。その結果、各化合物の投与により骨芽細胞・破骨細胞共に分化誘導状態の様々なバリエーションを確認することができた。その中で、細胞毒性をほとんど与えることなく細胞分化を強力に抑制する化合物を選抜し、ネオ基質の同定を試みた。生化学的な解析の結果、当該化合物の細胞への投与により、ネオ基質と考えられるタンパク質の著しいプロテアソーム分解が確認され、細胞分化制御の薬理作用として寄与している可能性を見出した。
細胞分化制御法の確立において、低分子化合物を用いたプロテインノックダウン技術に基づく表現型スクリーニングの一定の有用性が示されたが、技術確立と今後の医療応用に向けて、薬理作用のCRBN依存性を検証し、ネオ基質の細胞分化における機能を明らかにしていく必要がある。
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