CRISPR-Cas9の改変によるゲノム編集技術の効率化

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19284
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00467044)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2020-03-31
• Keywords: CRISPR

Outline of Annual Research Achievements

II型CRISPR-Cas系に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、革新的なゲノム編集ツールとして広く利用されている。現在ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9（SpCas9）と異なりNNNNCという配列をPAMとして認識する小型のB. laterosporus由来Cas9（BlCas9）は新規のゲノム編集ツールとして期待されている。BlCas9にHis6-SUMO-TEVプロテアーゼ認識配列を付加して大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。BlCas9のガイドRNAをT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro転写し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。精製したBlCas9、ガイドRNA、相補鎖DNA、PAMを含む非相補鎖DNAを混合することによりBlCas9-ガイドRNA-標的DNA複合体を再構成し、ゲルろ過カラムを用いて精製した。精製したBlCas9-ガイドRNA複合体を用いて様々な配列をPAMとしてもつ標的DNAをin vitroにおいて切断し、MultiNAマイクロチップ電気泳動装置を用いて切断産物を定量し、BlCas9によるDNA切断反応の経時変化を詳細に測定した。その結果、BlCas9のPAMに対する嗜好性が明らかになった。さらに、精製したBlCas9-ガイドRNA-標的DNA複合体を用いて結晶化スクリーニングを行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

高純度のBlCas9、ガイドRNA、および、BlCas9-ガイドRNA-標的DNA複合体の大量調製に成功し、結晶化スクリーニングを実施し、さらに、in vitroのDNA切断実験により、BlCas9のPAM特異性を検証できたため。

Strategy for Future Research Activity

BlCas9-ガイドRNA-標的DNA複合体の結晶化条件の検討を進め、大型放射光施設SPring-8においてX線回折データを測定し、結晶構造を決定する。結晶構造が決定できた際は、in vitroおよびin vivoの変異体解析を行う。さらに、構造情報を基に、PAM特異性の異なるBlCas9改変体を作製する。

Causes of Carryover

BlCas9-ガイドRNA-標的DNA複合体の結晶化条件の検討をさらに進め、結晶構造を決定する必要があるため。