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2020 Fiscal Year Research-status Report

CRISPR-Cas9の改変によるゲノム編集技術の効率化

Research Project

Project/Area Number 18K19284
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

西増 弘志  東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)

Project Period (FY) 2018-06-29 – 2022-03-31
KeywordsCRISPR
Outline of Annual Research Achievements

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。現在ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9(SpCas9)はNGGをPAMとして認識する一方、B. laterosporus由来Cas9(BlCas9)はNNNNCという配列をPAMとして認識するため新規のゲノム編集ツールとして期待されている。本年度は、BlCas9のPAM特異性の改変を推進した。BlCas9-sgRNA-標的DNA複合体の結晶構造を基に、BlCas9タンパク質にアミノ酸置換を導入した複数の変異体を作製し、大腸菌を用いて過剰発現させ、NiNTAカラムとイオン交換カラムを用いて精製タンパク質を調製した。精製タンパク質とガイドRNAを用いて、in vitroにおけるDNA切断実験を行い、PAM特異性を変化させるアミノ酸置換を複数同定した。これらのアミノ酸置換を組み合わせたBlCas9改変体を作製し、DNA切断実験を行い、PAM特異性の異なる複数のBlCas9改変体を取得することに成功した。さらに、野生型BlCas9およびBlCas9改変体をガイドRNAとともに哺乳類細胞に導入し、ゲノム編集活性および塩基置換活性を評価した。その結果、複数の標的遺伝子において変異導入を確認することができた。また、BlCas9に加えて、NNGRRTという配列をPAMとして認識する小型のS. aureus由来Cas9(SaCas9)に関しても立体構造に基づくPAM特異性の改変を行い、SaCas9改変体の取得に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

PAM特異性の異なるBlCas9改変体を取得できたため。

Strategy for Future Research Activity

哺乳類細胞におけるゲノム編集活性の向上したBlCas9改変体を同定する。

Causes of Carryover

BlCas9改変体をさらに最適化する必要が生じたため。

  • Research Products

    (4 results)

All 2021 2020

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (2 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme2021

    • Author(s)
      Takeda Satoru N.、Nakagawa Ryoya、Okazaki Sae、Hirano Hisato、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
    • Journal Title

      Molecular Cell

      Volume: 81 Pages: 558~570.e3

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2020.11.035

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Publisher Correction: Base editors for simultaneous introduction of C-to-T and A-to-G mutations2020

    • Author(s)
      Sakata Rina C.、Ishiguro Soh、Mori Hideto、Tanaka Mamoru、Tatsuno Kenji、Ueda Hiroki、Yamamoto Shogo、Seki Motoaki、Masuyama Nanami、Nishida Keiji、Nishimasu Hiroshi、Arakawa Kazuharu、Kondo Akihiko、Nureki Osamu、Tomita Masaru、Aburatani Hiroyuki、Yachie Nozomu
    • Journal Title

      Nature Biotechnology

      Volume: 38 Pages: 901~901

    • DOI

      10.1038/s41587-020-0585-1

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Structure, Mechanism & Evolution of CRISPR-Cas Enzymes2020

    • Author(s)
      Hiroshi Nishimasu
    • Organizer
      The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • Invited
  • [Presentation] Structure, Mechanism & Evolution of CRISPR-Cas Enzymes2020

    • Author(s)
      Hiroshi Nishimasu
    • Organizer
      MBSJ2020
    • Invited

URL: 

Published: 2021-12-27  

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