2019 Fiscal Year Research-status Report
Intra-nucleic and genomic distributions of liquid droplets formed by liquid-liquid phase separations
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18K19297
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白川 昌宏 京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | 液滴様構造体 / 光検出磁気共鳴法 / ODMR-FIONA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、近年多数発見されつつもその機能的役割が明らかでない液液相分離とその結果生じる”膜無しオルガネラ“の生成機構と生理的機能を明らかにするための方法論の開発を主たる目的とした。また膜無しオルガネラが細胞から消失する際にしばしば観察される、タンパク質凝集体繊維の形成メカニズムと構造物性・細胞毒性を明らかにすることを目指した。そのため、生きた細胞・生体で微細な物理パラメータの収集を可能にするナノダイヤモンドの量子センサーを開発し、タンパク質凝集体繊維形成に重要な流体力学的効果を検証するために工夫した”Rheo-NMR”測定を行なった。
ダイヤモンド結晶の格子欠陥の中で、超高感度磁気検出に利用可能な格子欠陥が「量子センサー」と呼ばれ注目されている。ダイヤモンド結晶中の不純物窒素原子(N)と空孔(V)からなる複合欠陥「窒素-空孔中心」 のスピン量子状態を光を利用して検出する方法は「光検出磁気共鳴法」と呼ばれ、蛍光顕微鏡を用いて電子磁気共鳴を測定する手法として注目されている。本研究では、NVC含有ダイヤモンド結晶をナノサイズの微粒子に加工し、プローブとして目的分子に標識し、ODMR計測することで目的分子の細胞内の向きや回転、粘性、温度等のパラメータを高速に精密に計測する、という技術開発を試みた。本年度は、必要な技術として(1)ナノダイヤモンド粒子の調製、（2）生体分子の標識技術、(3)量子センサー開発および(4)液滴計測を行うための量子センシング技術の開発を遂行した。その結果、(1)FUSの液滴を効率的にナノダイヤモンド標識する手法を発見した。(2)5ナノメートルナノダイヤモンドを量子センサー化することに成功した(2019, ACS Nano)。またナノダイヤモンドで粘度を求める手法の開発をすすめ、またpH計測技術の開発にも成功した(2019, ACS Nano)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、必要な技術として(1)ナノダイヤモンドによる液滴標識技術、(2)ナノダイヤモンドを用いた量子センサー開発および(3)液滴計測を行うための量子センシング技術の開発を遂行した。その結果、特定のタンパク質修飾を行ったナノダイヤモンドを用いることでFUS（Fused in Sarcoma）の液滴を効率的に選択的にナノダイヤモンド標識が可能であることを見つけた。5ナノメートルのデトネーションナノダイヤモンドに対して電子線照射を行うことで、量子センサー化することが可能であることを示し、世界最小の量子センサーの開発を成し遂げた。また、これの成果を論文として発表した(Terada et al., 2019, ACS Nano)。ODMR-FIONA法 (ODMR-fluorescence imaging with one-nanometer accuracy)を利用してナノメートル分解能で並進運動を捉える上で極めて重要な開発を行った。またナノダイヤモンドのランダム回転運動性を観測し粘度を求める手法の開発した。その過程で、ナノダイヤモンドを用いたリアルタイムpH計測技術の開発にも成功し、この成果も論文として発表した(Fujisaku et al.m 2019, ACS Nano)。特にpH計測については当初計画で想定していなかった進展であり、液滴動態観察などにおいて様々な情報を与えることが期待できる技術として本計画の進捗に大きく貢献した。
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| Strategy for Future Research Activity |
この研究が目指す技術的な目標は3つある。それは(1)特定ゲノム領域に標識したナノダイヤモンドを用いて、標識ゲノム領域の回転運動性を超高分解能一分子ナノジャイロセンシング法によって3次元で決定し、粘性を測定すること、(2)ナノダイヤモンドを用いた超解像イメージング技術であるODMR-FIONA法 (ODMR-fluorescence imaging with one-nanometer accuracy)を用いてナノメートルレベルでの精密並進運動を捉えること、更に(3)その際の熱力学的なパラメータを得るために精密温度計測を行うことである。いずれも我々のグループが独自に開発するものであり、先進的な定量計測技術であるが、更なるセンサーのマテリアル開発、および計測技術の開発を推し進める必要がある。マテリアルとしては、本研究で開発した5ナノメートルの量子センサーの表面化学修飾技術の実用化を急ぐ。計測技術開発としては、超高分解能一分子ジャイロセンシング法の更なる改良・開発を進める。更に、核内での特定のゲノム領域のターゲティングについては、現在進めているCRISPR/dCAS9システムとナノダイヤモンド分子標識システムとの融合を更に推し進める。このために、既に開発したタグ付きdCAS9特異的なscFvで親水化ナノダイヤモンドを修飾し、sgRNAを介した特定ゲノム領域の標識を実施する予定である。抗体を使ったDNAメチル化領域の形成は他研究者による前例があるので成功の確率が高いと予測される。
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| Causes of Carryover |
論文を執筆発表を計画していたが、追加データが必要なため発表は次年度以降になった
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Research Products
(8 results)
