2018 Fiscal Year Research-status Report
Re-engineering of AAV particle by "peptide insertion" method
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18K19298
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高木 淳一 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90212000)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | アデノ随伴ウイルス / 環状ペプチド / ターゲッティング / 遺伝子治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（項目１）PAタグを利用した、AAVキャプシドへのペプチド挿入デザインの評価と最適化： AAVのVP3キャプシド結晶構造をもとに、内部配列のうちキャプシド表面に突出したループを構成する領域を４カ所同定し、ここにPAタグ配列を挿入したAAVベクターをAAVpro Helper Free System（タカラバイオ）を用いて作製した。それらが細胞内で野生型同様に正しく粒子としてパッケージングされることを、リアルタイムPCRで確認した。
（項目２）ペプチド挿入型AAVベクターによる細胞感染の評価：発現カセットにGFP遺伝子を組み込んだpAAV-EGFPを自作し、これをpRCプラスミドとともにもちいて改変型AAV粒子を調製した。HEK細胞に感染させ、GFPの発現をモニターしたところ、４つの挿入変異体ごとに粒子形成能に与える影響がことなることがわかった。また、野生型のpRCプラスミドと共発現することでキメラウイルスを作製したところ、１００％変異型では粒子形成ができない場合もウイルスが得られることがわかった。
（項目３）AAV感染成立に必要な第2の相互作用部位の解明：AAV受容体であるAAVR（KIAA0319L）の組み換え可溶性タンパク質を作製し、精製タンパク質を得た。また、AAV2由来のVP3キャプシドタンパク質を抗原としたモノクローナル抗体を作製し、ネイティブのウイルスを高親和性で認識する抗体を９クローン樹立した。
（項目４）PAタグ以外のターゲッティング用ヘアピンターンペプチドへの応用： AAVキャプシド上にPAペプチド以外の配列、具体的にはMAPタグペプチドおよびヒトプレキシンB1結合性ペプチドmP6-9を挿入した変異ウイルスを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
項目１については実験系の構築を終了し、変異ウイルスとその遺伝子導入試験に必要なすべてのベクターをそろえることができた。また、４カ所の挿入候補部位の同定に成功した。項目２については、粒子形成を阻害する多くの変異体について、キメラ法によるウイルス発現方法を確立した。項目３についてはAAVRタンパク質の作製とAAVとの相互作用試験の構築を終え、さらに結合部位探索のための抗AAV2モノクローナル抗体の樹立も達成した。項目４はPAタグ以外のペプチド配列挿入を開始し、MAPタグ配列とmP6-9配列挿入体は完成させた。以上のことから、「当初の計画以上の進展」と自己評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
項目１については目的を達成したので本年度で終了とする。項目２については評価系は確立したが、GFP発現では定量性に問題があるので、今後のことを考慮してルシフェラーゼ発現ベクターに切り替えることを計画している。項目３について、まずはAAV2抗体のなかでAAVR結合を阻害するものがないか探索し、それが得られればそのエピトープを決定する。項目４についてはさらに異なるターゲッティングペプチドの挿入を行い、最終的には標的タンパク質を介した細胞への特異的感染成立を確認する。
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| Causes of Carryover |
予定の２４０万円のうち２０％ほどの使用にとどまったが、消耗品等としてはすでに経常経費で購入済みであった物品を充てたので研究遂行に支障はなかった。年度後半より、GFPではなくルシフェラーゼによる遺伝子導入能の定量評価が必要であることが明らかとなったため、発光専用のプレートリーダー購入を検討始めたが、年度内に決定できなかったため持ち越した。2019年度初めには同機が納入される予定であり、持ち越し学はほぼこれに充当される。
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