2019 Fiscal Year Research-status Report
Invention of the photoswitchable voltage-sensor
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18K19299
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
藤原 祐一郎 香川大学, 医学部, 教授 (20532980)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | イオンチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位依存性チャネルの電位センサーの構造と動作機構に基づき、新規の光駆動イオンチャネルおよび光駆動膜機能蛋白質を創製することを試みる。高速で光異性化を起こすアゾベンゼンを利用して、電位センサーを動かし、光によるイオンチャネル活性の制御や電位センサーに付加した酵素などの機能分子の制御を行う。分子構造や動作機構に立脚して戦略的に光駆動チャネル・光駆動性膜蛋白を創製するプラットフォームを構築することを目的として本研究を行う。
本年度は、扱いやすい最小ユニットで機能するHvチャネルおよびVSPの電位センサーを対象に実験を進めたうえで、実験ノウハウを確立させ、さらにより大きな電位依存性K+チャネル(shaker)に対象を広げ実験を進めた。構造解析情報を基に、電位センサーがResting構造からActive構造に変化する際に変わる残基間距離を計算した。光異性化距離に相当する残基ペアに、アゾベンゼン誘導体を架橋するためのCys変異を導入して、光駆動できるか試みた。Hvチャネルとshakerチャネルのキメラチャネルを作成し、光駆動できるか試みた。
S3-S4間距離、S2-S4間距離をアゾベンゼンの光異性化によりコントロールすることを試みた。網羅的に多くの変異体コンストラクトを作成し、変異体チャネルをXenopus卵母細胞に発現させ、アゾベンゼン誘導体をスルフヒドリル反応で付加し、光異性化波長を照射し、電気生理学的に測定した。より大きな電位依存性K+チャネル(shaker)では、光で操作することができる電位センサーを得ることが出来なかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究費で実験補助員(1名)を雇用し、変異体作成から電流解析まで一連の解析システムを拡張させ、他のチャネルへ解析を拡張させ、解析検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、扱いやすい最小ユニットで機能するHvチャネルおよびVSPの電位センサーで得られた実験ノウハウを拡張させ、さらにより大きな電位依存性K+チャネル(shaker)に対象を広げ実験を進めた。しかしながら、光で操作できる有効な変異体を得ることが出来なかった。期間中に、NMRを用いた電位依存性H+チャネルの立体構造が報告された。補助事業の目的をより精密に達成するために、NMR構造基盤に基づいてフォトスイッチ電位センサーを設計する再現実験を加え理解を深める必要が生じた。次年度は、追加（再現）実験の実施と論文発表のため期間延長して、構造－機能解析・分子計算まで含めて研究を進める。
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| Causes of Carryover |
当初計画では、電位依存性H+チャネルに光異性化試薬を結合させ、フォトスイッチ電位センサーを創製する研究を完了する予定であった。期間中に、NMRを用いた電位依存性H+チャネルの立体構造が報告された。補助事業の目的をより精密に達成するために、NMR構造基盤に基づいてフォトスイッチ電位センサーを設計する再現実験を加え理解を深める必要が生じた。追加（再現）実験の実施と論文発表のため期間延長を行う。
直接経費（2,440,449円）の使途は以下の通り
物品費：840,000円、旅費：50,000円、人件費：1,500,000円、その他：50,449円
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