2019 Fiscal Year Research-status Report
Platform for light-inducible, biochemical labeling of ribosomes in living single cells for the novel single-cell analytics based on seamlessly connected live cell imaging and transcriptomics
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18K19313
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
小松 直貴 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (30737440)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | ビオチン化 / 光遺伝学 / 蛍光タンパク質 / リボソーム / 1細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ライブイメージングで狙いを定めた1～数個の細胞について選択的に遺伝子発現を解析するための方法論の構築を目標としている。このために、①光照射により狙った細胞内のリボソームを化学修飾し、化学修飾の親和性を利用した精製によりリボソーム結合mRNAを回収して遺伝子発現解析を行うという方法、あるいは②細胞内の(全ての)タンパク質を化学修飾し、精製後に質量分析によりタンパク質レベルで遺伝子発現解析を行うという方法の2つの構築を目指している。これらの手法に共通して必要となる、細胞内分子の光依存的な化学修飾を実現するためのツールについて、現在開発を進めている。昨年度までに、紫色光により開裂する蛍光タンパク質PhoClと自己阻害ドメインERT2ならびに大腸菌由来タンパク質ビオチン化酵素birAを1つの分子として融合することで、基底状態ではbirAがERT2による立体障害を受けて不活性化しているが、光照射によるPhoClの開裂に伴うERT2の脱離によりbirA不活性化が不可逆的に解除されるという原理に基づく、光ビオチン化酵素を遺伝子工学的に開発することを検討した。まず候補分子を複数、遺伝子工学的に作成した。続いて候補分子を哺乳類培養細胞にて発現させ、細胞に紫色光を照射することで光依存的なタンパク質ビオチン化が細胞内で誘導できるか検討したところ、光照射無しの条件でも光非依存的なビオチン化が相当程度起きており、ERT2によるbirAの不活性化(ケージング)が不十分であることが示唆された。より効率の良いケージングを実現するために、今年度は、ケージングに用いる機能性分子について、蛍光タンパク質やそれ以外の光遺伝学関連分子について検討を行った。さらにbirA以外のビオチン化酵素改変体の選定を行い、これらの候補因子を組み合わせた光ビオチン化酵素候補分子の発現プラスミド構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度までの検討により、birAのN末端およびC末端にPhoClおよびERT2を付加した候補分子ではbirAのケージングがほとんど起きないことが判明した。ERT2ではケージング効率が不十分である可能性が考えられたので、今年度は昨年度に引き続き蛍光タンパク質の2量体化をbirAのケージングに利用できないか試した。すなわち紫色光依存的なホモ2量体化を示す蛍光タンパク質pdDronpaを単独で、あるいはPhoClと共にbirAに融合し、光依存的なbirAのアンケージングが誘導できるか検討した。しかしながら基底状態におけるbirA不活性化は不十分であった。蛍光タンパク質以外の光依存的な2量体化を示す機能性タンパク質をケージング分子として利用することを考え、次に光遺伝学で活用されているMagnet系およびiLiD/SspB系を候補分子として選定した。更にビオチン化酵素についても、報告されている改変体であるBioID, TurboID,miniTurboについて検討を試みた。
一方で、ビオチン化酵素のケージングが何らかの理由によりそもそも困難である可能性を考え、ケージングとは別に、分割型のビオチン化酵素Split-BioIDを光依存的に再構成させるというデザインの開発についても検討した。今年度は上述の候補分子を分子内に組み込んだ、光ビオチン化酵素の候補を発現するプラスミドの構築を進めた。光照射実験を効率良く進めるために必要なアレイ型光照射装置および光照射実験と共存可能な顕微鏡自動焦点あわせ装置についても購入を行った。
概して、細胞内ビオチン化反応の光依存的な制御が当初の期待と反して、十分なレベルで達成できておらず、種々の候補分子を作製・評価する必要性が生じた点で、当初計画と比べて少し遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は今年度に引き続き、光ビオチン化酵素の候補分子群について、発現プラスミド構築および培養細胞での機能評価を進めていく。現在は光ビオチン化酵素のビオチンリガーゼ活性を評価する上で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いたウェスタンブロッティング法により評価しているが、評価効率を高めるため、蛍光色素標識ストレプトアビジンを用いた蛍光免疫染色法と自動化顕微鏡法により、細胞内ビオチン化を評価できるよう、そのための実験系も構築する。首尾良く光依存的なビオチン化を達成できた場合には、被ビオチン化タグ付加リボソームをおとり(バイト)として利用したmRNAの回収と引き続く遺伝子発現解析、あるいは光ビオチン化酵素によってビオチン化された内在性タンパク質の質量分析がどの程度実行可能か、検証を行う。
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| Causes of Carryover |
光ビオチン化酵素の開発が遅れているため、その後に引き続く細胞内ビオチン化リボソームからのmRNA回収法の検討、および細胞内ビオチン化タンパク質の回収・分析法の検討が未着手であり、そのために当初使用予定であった分の助成金について執行が遅れている。このため次年度使用額が生じた。令和2年度では令和1年度で生じた次年度使用額および令和2年度請求分の助成金を併せて、光ビオチン化酵素の開発および引き続くmRNA回収法やビオチン化タンパク質回収法の検討を進める予定である。
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