Platform for light-inducible, biochemical labeling of ribosomes in living single cells for the novel single-cell analytics based on seamlessly connected live cell imaging and transcriptomics

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19313
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 小松 直貴 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (30737440)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2022-03-31
• Keywords: 光操作 / ビオチン化 / 生細胞イメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、生細胞イメージングで狙いを定めた1～数個の細胞について選択的に遺伝子発現を解析するための方法論の構築を目標とし、目標達成にあたり必要となる、細胞内のタンパク質分子（の一部）を光依存的に化学修飾するためのツールの開発を進めている。
これまでに、蛍光タンパク質の2量体化または光開裂性蛍光タンパク質の利用によりタンパク質ビオチン化酵素にケージングを施し、光依存的かつ不可逆的にアンケージングするという系をデザインし、系の構築および機能評価を進めてきた。しかしながら上述の方策によるケージングが(少なくともビオチン化酵素については)技術的に困難であることが判明した。そこで2020年度は、光依存的にヘテロ2量体化する系であるMagnet系またはiLiD/SspB系とスプリット型のビオチン化酵素を組み合わせることで、光依存的にビオチン化活性を回復するビオチン化酵素の開発を目指した。まず培養細胞でMagnet系による光依存的な2量体化が可能か検討した。Magnetの構成因子nMagおよびpMagについて、細胞内局在化シグナルまたは蛍光タンパク質を融合したタンパク質を作製し、ヒト由来培養細胞であるHeLa細胞に一過性発現させ、蛍光顕微鏡観察下にて青色光をパルス照射した。光依存的なMagnetのヘテロ2量体化に伴う赤色蛍光タンパク質シグナルの局在変化が観察されることを期待したが、変化は観察されなかった。一方で同様の実験をiLiD/SspB系で行ったところ、青色光依存的な蛍光シグナルのロバストな局在変化が観察された。そこでiLiD/SspB系をベースとし、スプリット型ビオチン化酵素の一つであるsplit-TurboIDを光依存的に近接させることでTurboIDを再構成する系の遺伝子工学的作製を現在進めている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

コロナ禍により、令和2年度に予定していた研究計画の多くが実施できなかった。このため進捗に遅れをきたしている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き光ビオチン化酵素の発現プラスミド構築および培養細胞での機能評価を進めていく。現在は光ビオチン化酵素のビオチンリガーゼ活性を評価する上で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いたウェスタンブロッティング法により評価しているが、評価効率を高めるため、蛍光色素標識ストレプトアビジンを用いた蛍光免疫染色法と自動化顕微鏡法により、細胞内ビオチン化を評価できるよう、実験系を構築する。

Causes of Carryover

コロナ禍により、令和2年度に予定していた研究計画の多くが実施できず、そのため次年度使用分が発生した。令和3年度は、前年度請求分の助成金を用いて引き続き開発を進める。