2019 Fiscal Year Research-status Report
プラナリアの生殖様式は共生細菌によって制御される：有性排除の仕組みの解明
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18K19318
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
小林 一也 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50360110)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | プラナリア / 有性生殖 / 無性生殖 / 生殖様式転換 / 共生細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先行研究により、プラナリアの無性化に働く共生細菌が存在し、その働きによる有性化抑制の仕組みが存在していることが予想できた。2018年度は、16SrRNA配列に注目したメタゲノム解析によってプラナリアの無性化に働く共生細菌を探索し候補細菌を絞り込む一方で、候補細菌の培養系を確立し、その16S rRNA配列を決定して、メタゲノム解析で絞られた候補細菌の配列と一致するかを確かめることで、無性化共生細菌を同定することを目指した。その結果、16S rRNA配列の比較による細菌叢解析により、同種プラナリアであっても無性個体と有性個体に共生している細菌叢が有意に異なることを明らかにした。さらに、無性個体に有意に存在しているグラム陰性菌を3種絞り込んだ。核酸ペプチド(PNA)を用いた細菌のノックダウン法により、3種の候補細菌のうち1種が無性化共生細菌であると同定できた。
2019年度は、無性化共生細菌が合成していると予想される無性化因子を単離・同定すること成し遂げるために、無性化共生細菌の培養系確立を目指した。グラム陰性菌とグラム陽性菌両方に強く効き目のあるテトラサイクリンおよびフラジオマイシン（ネオマイシン）、主にグラム陽性菌に効果のあるアンピシリンの３種の抗生物質を無性個体に投与し、16S rRNA配列の比較による細菌叢解析を行った。その結果、同定した無性化共生細菌はテトラサイクリンおよびフラジオマイシン処理で無性個体から除去されたが、アンピシリン処理では影響がほとんどないことがわかった。無性個体をホモジナイザーで懸濁した組織液に存在する無性化共生細菌だけが生き残れるようにアンピシリンを添加した寒天培地で培養するなど検討を行った。形成されたコロニーに対して、無性化共生細菌特異的プライマーを用いてPCR検査をしたところ、いくつかのコロニーに陽性の結果が最近得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度の目標である無性化共生細菌の選別に用いることのできる抗生物質の選定と、寒天培養系の確立ができたので、(2)おおむね順調に進展している、と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最近、得られた寒天培地でクローニングされた陽性コロニーについてPCR断片のシーケンスを行い、目的の無性化共生細菌であるかを検証する。無性化共生細菌が特定できた場合、市販の栄養培地や無性個体の抽出物などを添加することで培養方法を検討し、無性化共生細菌の液体培養系を確立する。培養系の確立後は、大量培養した無性化共生細菌抽出物をメタボローム解析やHPLCで分画して、プラナリアの無性化に働く活性をもつ化合物（無性化因子）を分離していく。候補物質が得られた場合は、有性化活性を含んでいるイズミオオウズムシのホモジネートに候補物質を混合して凍結乾燥したものを検定餌とし、無性個体30匹の検定個体に毎日１片ずつ与える。4週間の給餌後、実体顕微鏡下で検定個体を観察し、有性化への抑制状態を確かめる。抑制効果が認められた場合、候補物質を無性化因子として同定する。
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| Causes of Carryover |
2019年度に予定していた学会発表の準備が間に合わなかったので、2019年度に予算立てしていた旅費は本年度に使用する。
2019年度に予定していたメタゲノム解析の一部やメタボローム解析が間に合わなかったので、それに伴い、それに必要な消耗品（物品費）と外部委託費を本年度に繰り越すこととなった。
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