RAC1光スイッチによるアクチン重合・分岐の急速凍結クライオ電子線トモグラフィー

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19328
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 中田 隆夫 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (50218004)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 稲葉 弘哲 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (80791334)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: 光遺伝学 / クライオ電子線トモグラフィ / RAC1 / 葉状仮足

Outline of Annual Research Achievements

近年のクライオ電子線トモグラフィの技術の進展により細胞内のアクチン線維のネットワークの三次元観察が可能となってきている。葉状仮足は、Rhoファミリー低分子量Gタンパク質であるRac1により形成される枝分かれしたアクチンに富むシート状の突起であり、細胞運動や細胞分裂、癌の浸潤転移などにおいて機能するため、その先端のアクチン重合部位の構造を明らかにすることは細胞生物学的にも病理学的にも非常に重要である。本研究は光遺伝学の技術を用いて、青色光によって活性化するRAC1光スイッチによって葉状仮足形成を促し、急速凍結した細胞試料をクライオ電子線トモグラフィに供することで、葉状仮足形成におけるアクチンネットワークの経時変化を明らかにすることを目的としている。
初年度に取得したクライオ電子線トモグラフィ像からアクチン線維のセグメンテーションを試みたが、微小管の太さであれば鮮明な画像であったが、アクチン線維はS/N比の高さから1本1本の線維を正確に抽出することが困難であった。
本年度の秋頃に利用していた大阪大学のクライオ電子顕微鏡Titan Krios(FEI)にボルタ位相板が導入され、コントラストの向上が期待された。そこで再度Rac1光スイッチを発現するCOS7細胞を光刺激した後に、急速凍結し、クライオ電子顕微鏡で連続傾斜像を撮像した。位相板によりコントラストは大きく向上したが、凍結の条件が悪く氷が厚かったために現在の条件での最良の像を得ることができなかった。凍結直前のろ紙での吸い取り時間を長くすることで改善を試みたが、コロナ禍により大阪大学の施設利用が停止となり実験が中断してしまった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上記のようにコロナ禍により、クライオ電子顕微鏡の利用ができなくなったため。

Strategy for Future Research Activity

凍結直前のろ紙のブロット時間を条件検討し、最適の条件を探る。ボルタ位相板を利用し、クライオ電子顕微鏡で観察し、アクチン線維１本１本を明確にトレースできるかを検討する。

Causes of Carryover

コロナ渦により利用ができなくなっていたクライオ電子顕微鏡による条件検討を再開し、よりインパクトファクターの高い雑誌への投稿を行う。