2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of innovative embryo manipulation system for genetically modified marmoset
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18K19375
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
笹岡 俊邦 新潟大学, 脳研究所, 教授 (50222005)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | マーモセット / 卵巣 / 免疫不全マウス / 異種間移植 / 体外受精 / 胚操作 / 胚盤胞補間法 / ドーパミン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
<目的>近年ゲノム編集技術の発展により比較的容易に遺伝子改変が様々な動物で行えるようになってきた。実際に遺伝子改変モデルマーモセットを作出するためには多くの受精卵の獲得、及び精子の採取と凍結保存が必須である。本研究では、３つの項目に取組んでいる。第１は「マーモセット成熟卵子・受精卵の安定的生産方法の開発」、第２は「異種間移植卵子を用いた脳疾患モデルの作製」、第３は「ナイーブ化ES細胞の樹立と胚盤胞補完法による遺伝子改変動物の作製」である。京大霊長研・中村グループ、東大・饗場グループ、理研CBSの複数のグループ、群馬大・平井グループなど、複数の研究室から卵巣の提供を受け、免疫不全マウスに移植し、卵子の採取に取組んでいる。今年度は新生児の卵巣の異種間移植にも着手した。また、マーモセット精巣上体尾部精子の凍結保存を行った。
<方法>「マーモセット卵巣の異種間移植」(1)冷蔵輸送後の新生児の卵巣を採取した。(2)事前に左右卵巣を除去した免疫不全マウスの腎被膜下に卵巣片を移植した。(3)移植したマーモセット卵巣の機能開始を調べるため、週２回、免疫不全マウスの膣開口を確認した。
「卵黄糖液による精子の凍結保存」(1)輸送後の精巣上体尾部を卵黄糖液内にて細切した。(2)精子懸濁液を作製し、室温から4℃まで2時間かけて冷却した。（3）精子懸濁液と同量の耐凍剤入り保存液を添加した。（4）プラスチックストローに封入後、液体窒素液面上に静置し凍結した。
<結果>新生児卵巣を移植した免疫不全マウスはまだ膣開口が認められていないが、引き続き、性周期開始を確認し、確認ができた個体には性ホルモン投与を行い、卵子採取を行う。通常、マーモセットは1.2-1.5歳で性成熟を迎える。この研究を進める中で、明らかにしたい。冷蔵輸送後の精巣上体尾部より運動性を有する精子を回収することができ、それら精子の凍結保存を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、霊長類の脳構造・機能マップ作製に必須な遺伝子改変マーモセットを確実かつ低コストで作製する胚操作技術の開発をめざす。そのために、次にあげる３つの研究開発項目を立てて遂行してきた。
第１、マーモセット成熟卵子・受精卵の安定的生産方法の開発、第２、異種間移植卵子を用いた脳疾患モデルの作製第３、ナイーブ化ES細胞の樹立と胚盤胞補完法による遺伝子改変動物の作出
そこで、2019年度は、本研究遂行のための基盤整備を行った。まず、マーモセットの発生工学研究に必要な一定数の動物を飼育維持するために、動物実験施設内にマーモセット飼育スペースの拡張整備をおこなった。次に、マーモセット胚の採取または移植するメス個体の性周期を管理するために必要な血中ホルモン測定機を導入し、飼育メス個体の性周期チェックを開始した。研究開発項目の第１及び第２に関連する、本研究の肝である成熟卵子の安定的生産法の開発では、マーモセット卵巣を免疫不全マウスに移植し、ホルモン誘起により成熟卵子を取得する。2019度は、遺伝子改変マーモセットワーキンググループのご努力により、複数の施設から定期的にマーモセット卵巣試料の提供を受けることができるようになり、移植用卵巣の安定な確保に目処が付いた。その結果、本研究遂行上では、卵子の安定的な採取が、律速段階となっているが、卵巣試料や移植の条件を検討することができた。このことで、成熟卵子を生産する基盤ができたと考えている。また、研究項目３に関しては、既存のマーモセットES細胞を用いて、ナイーブ化ES細胞の樹立に必要な培地組成や添加物等の検討をおこない、コロニー形態に関連する構成因子を複数見いだした。また、胚盤胞補完法に使用するマウス受容胚を生産するために、生殖組織を欠損しかつ免疫不全のマウスコロニーの拡大を行い、次年度以降年間10回以上の実験ができる準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
第１：マーモセット成熟卵子・受精卵の安定的生産方法の開発：ⅰ）異種卵巣移植による卵子取得の至適化を行い、卵子の安定取得体制を整備する。複数の研究室から提供されるマーモセット卵巣組織について、その個体ごとの性質が、免疫不全マウスに移植したマーモセット卵巣からの卵子作製に及ぼす影響等を調べる。ⅱ）凍結保存した卵巣の利用を検討する。凍結保存したマーモセット卵巣組織の有用性を検討する。とりわけ、凍結方法、組織の細切形状、融解法等の条件を決める。ⅲ）卵子・胚培養条件を検討し、子宮移植可能な時期まで発生する胚の培養条件を策定する。体外培養については、培地組成と添加物、温度、酸素およびCO2ガス濃度などを至適化し、取得したマーモセット卵子が８細胞期胚以降に発生する培養条件を策定する。
第２：異種間移植卵子を用いた脳疾患モデルの作製：第１の項目で取得された受精卵を対象にCRISPR/Cas9による変異導入効率を決める各種条件を検索する。遺伝子編集に用いる具体的な手法とガイドRNA配列を選定して、マーモセット培養細胞及び取得した受精卵を用いてその効率を測定し、至適条件を策定する。なお、ドーパミン受容体にin/del変異を惹起するガイドRNAも選定する。
第３：ナイーブ化ES細胞の樹立と胚盤胞補完法による遺伝子改変動物の作製：ⅰ）異種間キメラ用精巣形成不全マウス受容胚の作製と、ⅱ)マーモセットES細胞ナイーブ化状態維持因子の同定をおこなう。胚盤胞補完法用の受容胚産生マウスコロニーを拡充する。なお、これら胚の品質管理は、ラットES細胞を用いておこなう。既製マーモセットES細胞を用いて、基礎的な培養条件を決定する。ⅲ）マーモセットES細胞での遺伝子組換え条件の検討については相同組換えを検出する選択薬剤や、コロニー管理、凍結法など多能性幹細胞を未分化に保ったまま遺伝子組換えができる諸条件を策定する。
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| Causes of Carryover |
今後の研究の推進の方策として、３つの課題、すなわち（１）マーモセット成熟卵子・受精卵の安定的生産方法の開発,（２）異種間移植卵子を用いた脳疾患モデルの作製,（３）胚盤胞補完法による遺伝子改変マーモセット精子取得法の確立の研究を予定している。マーモセット研究を実施している施設からマーモセット卵巣や精巣上体の提供をいただくことが研究推進に大きく依存する。マーモセット試料をご提供いただくためにさまざまな機会をとらえて尽力し、これらの方策を有効に進めるために、研究経費として、本次年度使用額と翌年度分として請求した助成金と合わせて執行したい。
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