2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K19402
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
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2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム配列 / 核酸結合色素 / TALE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、PYPタグラベル化技術の改変とこのラベル化技術とゲノム編集技術を応用したDNA配列検出技術の開発を行った。これまでに、PYPタグと呼ぶタグタンパク質と合成蛍光プローブを利用したタンパク質ラベル化技術を開発してきた。PYPタグは、桂皮酸やクマリンの誘導体とリガンドとして共有結合で結合することが知られている。これらのリガンドと蛍光色素を連結したプローブにより細胞内のPYPタグ融合タンパク質を特異的にラベル化しイメージングすることに成功してきた。一方、桂皮酸やクマリンをリガンドにした場合、プローブを合成するステップ数が多くなり、プローブ改変が困難になることや、分子サイズが大きくなり脂溶性が高くなり凝集しやすくなることが問題であった。DNA配列を検出する技術に応用する場合、この点は大きな問題であった。そこで、この問題を解決するために、新規リガンドの開発を行った。種々のリガンド候補化合物を探索した結果、高活性にPYPタグに結合する分子を発見した。
本年度実施したもう一つの研究は、PYPタグラベル化技術により、TALEやdCas9などのDNA配列に特異的に結合するタンパク質を核酸結合色素で標識したことである。この標識体を用いたDNA配列検出技術では、DNA結合タンパク質が標的DNA配列に結合したとき、色素が近接効果によりその周辺DNAに結合し蛍光強度が上昇することを利用している。まず、既存のPYPタグリガンドに核酸結合色素を連結した分子を開発し、TALEやdCas9を標識した。dCas9標識体では、標的DNAに結合したときの蛍光強度上昇は観測されなかったものの、TALE標識体では、標的DNAに結合すると蛍光強度が上昇した。後者の標識体は、ゲノム配列をイメージングする有用なツールになると期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リガンド候補分子の探索の結果、PYPタグラベル化技術の根幹をなすリガンドの高活性化に成功した。更には、当初の目標のとおり、PYPタグラベル化技術とゲノム編集に用いられるTALEを組み合わせることで、標的DNAに結合し蛍光強度を上昇させる新たな化学ツールの開発に成功した。今後ゲノム配列をイメージングするのに、有用なツールとなる可能性を示すことができた。以上の結果から、本年度の研究の進展は、おおむね順調であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、新たに発見した高活性リガンドに蛍光色素を繋いだ蛍光ラベル化プローブを開発し、タンパク質を細胞内でラベル化し蛍光イメージングを行う。また、このリガンドに核酸結合色素を繋いだ分子の開発も同時に進めていく。また、今年度開発したDNA配列検出プローブを生細胞イメージングへと展開していく。生細胞イメージングにおいては、プローブを構成するタンパク質部位は、細胞内で遺伝子発現して作成し、そこに、ラベル化分子を添加することで、目的のプローブを細胞内で構築できるかを検証する。また、この技術によって、標的DNA配列を時間軸に沿って可視化できるかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
PYPタグリガンドの探索の結果、予測を超える活性でPYPタグに結合する構造を持つ分子を発見した。ゲノム配列検出技術の開発のうえで、PYPタグを高活性にラベル化することは極めて重要である。このため、リガンド探索を更に続ける必要性が生じ、今年度末に最終的に天然リガンドを超える活性を持つものを発見した。このため、次年度に、このリガンドをベースにして、核酸結合色素を繋いだ分子を開発する必要が生じ、そのための経費が生じた。
来年度は、リガンドと核酸結合色素を繋いだ分子を合成・精製するための試薬の購入経費として1,000,000円、開発した分子を用いた生化学実験のための試薬の購入経費として500,000円、ゲノムイメージングのための細胞生物学試薬の購入経費として559,506円を支出する予定である。
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