2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Fundamental Technique for 4D Chemical Nucleomics
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18K19402
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | ハイブリッドプローブ / ゲノム / DNA結合タンパク質 / ラベル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム動態を可視化するツールとして、PYPタグラベル化技術とゲノム編集技術を応用し、特定のDNA配列に結合した時、蛍光強度を上昇させる蛍光プローブを開発することを目的とした。蛍光プローブの設計は、DNAに結合した時に蛍光性となる色素で、ある特定のDNA配列に特異的に結合するDNA結合タンパク質をラベル化した合成色素/タンパク質ハイブリッドプローブを構築することとした。この設計原理では、タンパク質部位が特定DNA配列に結合したときのみ、色素部位がその周辺DNAに結合することで蛍光強度が上昇する。また、重要な点であるが、色素とタンパク質の特異的なラベル化反応は、PYPタグラベル化技術を用いる。すなわち、DNA結合タンパク質部位にはPYPタグを融合させ、PYPリガンドを連結した色素を用いることで、ラベル化反応を細胞内で引き起こす。まず、DNA結合タンパク質をdCas9、TALE、またはZFとしたハイブリッドプローブを構築した。TALE及びZFをタンパク質部位としたハイブリッドプローブは、標的DNAに結合すると蛍光強度が上昇した。この結果から、DNAに結合し蛍光性となるハイブリッドプローブの開発に成功した。一方、これまでに開発した桂皮酸やクマリンを母骨格としたPYPリガンドでは、細胞内でのラベル化効率や水溶性、合成ステップ数に問題があった。そこで、まず、新たなリガンドを探索・分子設計・合成することで、最終的に高水溶性、高膜透過性、高ラベル化効率かつ合成ステップ数の少ない新たなリガンドPCAFを開発した。最終年度には、このPCAFリガンドに色素を連結したPYPタグラベル化分子を開発し、細胞内でラベル化できることを確認した。本結果は、細胞内で機能するハイブリッドプローブ開発とゲノム動態可視化ツール開発のうえで、有用な知見を提供する。
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