2019 Fiscal Year Annual Research Report
Efficient suppression of random DNA integration
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18K19407
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
足立 典隆 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科(八景キャンパス), 教授 (30264675)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | NHEJ / ゲノム編集 / DNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
応募者は、非相同末端連結NHEJとDNAポリメラーゼθ(PolQ)を同時に欠損させると、細胞に導入したベクターのランダムな組込みが完全に抑制され、相同組換えを介した組込みしか起こらなくなることを発見した。そこで本研究では、この表現型を遺伝子ノックアウトに依らず再現するための手法を開発することにチャレンジした。また、PolQの詳細な機能についての多くは未解明であるため、化合物スクリーニングによる阻害物質の探索と並行して、ヒトPolQの構造と機能の相関に関する遺伝学的解析を進めた。詳細は以下の通り。
・構築済みのNHEJ欠損細胞(CRISPRを使用せずに相同組換えで作製したノックアウト細胞株)を利用して、表現型の違いを指標とした化合物スクリーニングを実施し、候補となる化合物を得た。
・ヒトPolQのN末端領域に存在するATPaseドメインやRad51結合ドメイン(いずれも他のDNAポリメラーゼには存在しないユニークなドメイン)の変異体を発現させた際の表現型の変化を観察した。また、ポリメラーゼドメインや核移行シグナルに変異を入れた際の影響についても調べた。さらに、他種由来のPolQとのキメラ型タンパク質の発現ベクターを多数構築し、遺伝子挿入やDNA修復における各ドメインの役割と重要性を調べた。
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Research Products
(3 results)
