2018 Fiscal Year Research-status Report

New method for tanzaku-shape molecule encapsulation: application to dynamic nuclear polarization NMR of proteins

Research Project

Project/Area Number	18K19408
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	樋口恒彦名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (50173159)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	動的核偏極 / NMR構造解析 / ペンタセン / シクロデキストリン / 水溶化 / 平衡反応 / 迅速測定
Outline of Annual Research Achievements	ペンタセン類は、一つの励起三重項状態分子が周囲の多数の分子の核偏極を引き起こし、室温でそれらのNMRの感度を数万倍まで高める機能を有する。もしタンパク質の構造解析に応用できれば、超迅速測定法につながり、意義は大きい。しかし、ペンタセン類は疎水面が広く、通常の修飾で水溶化は構造上困難であり、さらに光に対して不安定であるため、そのままでは応用不可能である。そこでシクロデキストリンを用い、不可逆的な封入を行って、水溶化を図ると同時に、光に対する安定化も図り、これを用いた動的核偏極による、微量のタンパク質等のNMR測定を種々実施し、極めて迅速なNMR構造解析新手法への道を拓くことを目的としている。平成30年度は、シクロデキストリン(CyD)に共有結合可能なペンタセン誘導体の合成と、ペンタセンに共有結合可能なシクロデキストリンの誘導体の合成から研究を開始した。初めに、クリック反応が行えるように片方にアルキンを、もう片方にアジド基を導入したものを合成することとした。CyDへのアジド基導入は行うことができたが、アルキンが結合したペンタセンの合成は、既知の化合物であるものの、困難なところがあることがわかった。かなりの反応回数の合成を行っていて、反応終了直後には相当量の目的物生成が確認できたが、2度のカラム精製で急速に目的物が減少し、最終的には極微量得られるのみに留まっている。これは、ペンタセン骨格が、自身の光増感能によって生じた一重項酸素と容易に反応することや、ペンタセン同士の二量化などが考えられたため、暗所で脱気した溶媒を用いた迅速なカラム精製などで対処しているが、未だ大幅な改善には至っていない。そのため、合成法のさらなる工夫やペンタセン誘導体の変更も視野に改善策を検討している。上記以外にも、非共有結合的に包接作用だけによる複合体形成に関しても検討を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason CyD誘導体の合成・精製に関しては、それらが水溶性で非常に極性が高く、UV吸収もないため、通常有機合成に用いる技術があまり適用できず、特殊で困難を伴う合成であったが、こちらは必要量の合成にこぎ着けた。一方、ペンタセン骨格を含む化合物については、当初の予想よりはるかに不安定であり、さらに有機合成化学の常法が適用困難であったため、未だ必要量の合成に至っていない。この課題は、2018年12月から研究室に配属間もない学部3年生が取り組んでいるための経験不足も影響しており、さらに2019年に入ってからは就職活動が始まったことも相まって、現在のところ必要な化合物の合成に遅れが生じている。
Strategy for Future Research Activity	ペンタセン誘導体の非常に高い光不安定性に対処するため、暗所で迅速分離し粗精製のまま、CyD誘導体との結合生成を行い、安定化した目的化合物をHPLCや逆性カラム等で精製して目的物を得ていく方式をとる。また、グローブボックスを用いたペンタセン精製を行う方策も考えられるが、グローブボックスを当研究室で保有していないため、他研究室のものを借りて、嫌気条件で分離精製を行い、CyDとの結合反応も行う。次に、CyDをスペーサーを挟んで二量体とし、ペンタセン誘導体の疎水平面をほぼ全てカバーするものを合成し、ペンタセンやその誘導体との包接化合物を得て、その安定性を評価する。さらに、ペンタセンの部分構造であるアントラセン構造が一重項酸素との反応性が高いことから、ペンタセンの炭素を一部窒素に変換し、一重項酸素と反応し難い構造する。その分子をお持ちいて上記のようなCyD誘導体を用いた包接により、水溶性の動的核偏極に用いることのできる分子の創製も行っていく。研究課題を担当する学部学生に対しては、指導をより密に行い、合成や測定の技術を身につけさせることにより、効率的な研究推進が行えるようにしていく。
Causes of Carryover	研究の実質的な開始時期が、10月に配属された学生の合成のトレーニングの都合で2018年12月になったことにより、研究期間が3ヶ月あまりと短かったため、消費した試薬・溶媒・ガラス器具類が、当初計画よりも大幅に少なかったことが、主な差が生じた要因である。また、ペンタセン誘導体の合成が、その予想を遙かに上回る不安定性のために必要量得るまでになかなか進まず、化合物合成が当初計画ほど先に進展していかなかったことも挙げられる。