2020 Fiscal Year Research-status Report
ツメガエル卵母細胞を利用した新規の膜電位依存性酵素の同定
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18K19428
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2022-03-31
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| Keywords | 膜電位 / イノシトールリン脂質 / アフリカツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)今年度新規に膜近傍のPIPsを検出するのに適したFRET型のPH domain融合たんぱく質であるf-PLC（PI(4,5)P2感受性）およびf-TAPP（PI(3,4)P2感受性）を導入し、voltage clamp fluorometry法によりPI(4,5)P2およびPI(3,4)P2の変化の時間分解能の向上をはかった。予測通り、VSP酵素活性に伴う速い変化を捉えることができるようになった。一方、予想外の結果として、PIP3からPI(3,4)P2を生成する内在性酵素活性のシグナル強度が極めて低いことが明らかになった。f-PLCで検出されるVSPのPI(4,5)P2－＞PI(4)P活性には影響が見られなかった。このことから、内在性酵素活性については、平成30年度の結果においても観察されたように、イノシトールリン脂質のプローブの種類によって検出のされかたが異なることが明らかになった。PI(3,4)P2感受性チャネルであるXenopus tropicalis由来TPC2の電位依存的活性化をXenopus oocyteに発現させるとPI(3,4)P2の増加を反映する電流が検出されることから、平成30年度の実験により確認したようにプローブによるアーチファクトではないことは確かであり、VSPと内在性活性の間でアシル基の多様性により基質へのpreferenceが異なるという可能性と、プローブの種類が異なることで検出されるPIPsの細胞内分布が異なる可能性、即ち同じPI(3,4)P2でも空間的分布パターンがVSPの場合と内在性活性の間で異なると考えられる。
(2)アフリカツメガエル卵母細胞とアカハライモリ卵母細胞でトランスクリプトーム解析による比較により新規膜電位依存性酵素の分子実体を明らかにすることを目的として、アカハライモリを入手したが、質の高いRNAを得る条件検討が十分に進まなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新たなPIPsセンサー蛍光分子を導入することに成功し、用いるプローブ間で検出レベルが異なるという事実が判明した。この知見は、今後の内在性酵素活性の分子機序を理解する重要な糸口となると期待される。用いるPI(3,4)P2感受性プローブ間で、シグナルが異なる背景として、内在性酵素活性とVSPとでは、アシル基の不飽和度や長さなどで、異なる分子グループを認識している可能性が考えられる。他のプロジェクトにおいての共同研究先では少数の細胞からの質量分析技術が開発されており、この計測法を組み合わせることで今後分子実体のスクリーニングが促進できる可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
イモリ卵母細胞から質の良いRNAを得る条件を探して、トランスクリプトーム解析を進めて、候補分子を探索する。前年度に計画したように、キナーゼ分子も含めて複数の分子の発現量の比較をおこなっていく。またFRET型プローブと単一蛍光分子プローブとでのシグナルの違いの背景を解明することで、分子実体のスクリーニング過程を促進させる。
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| Causes of Carryover |
（理由）内在性酵素によるFRET probeを用いたシグナルの解析が立ち上がり、重要な端緒が得られつつあるが、現状の対物レンズよりも開口数の大きなレンズを導入することで、更に詳細な解析が可能になると考えられる。光学系を新たに組み直すことでシグナル強度の改善を目指す。またアカハライモリは入手時期により卵の質が異なるため採集業者との密な連絡をとり、質の高いRNAを得ることを実現する。
（使用計画）研究計画に大きな変更はなく、前年度の研究費を含めて、当初の予定どおり計画を進めていく。
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[Journal Article] TRPM5 Negatively Regulates Calcium-Dependent Responses in Lipopolysaccharide-Stimulated B Lymphocytes2020
Author(s)
Sakaguchi T, Okumura R, Ono C, Okuzaki D, Kawai T, Okochi Y, Tanimura N, Murakami M, Kayama H, Umemoto E, Kioka H, Ohtani T, Sakata Y, Miyake K, Okamura Y, Baba Y, Takeda K.
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Journal Title
Cell Reports
Volume: 31
Pages: 107755
DOI
Peer Reviewed
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