2018 Fiscal Year Research-status Report

ボルナウイルス感染細胞の運命：ウイルスの新たな神経病原性を探る

Research Project

Project/Area Number	18K19443
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	堀江真行京都大学, 白眉センター, 特定准教授 (20725981)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	ボルナ病ウイルス / Cre / 感染排除
Outline of Annual Research Achievements	本年度はCreリコンビナーゼ発現組換えボルナ病ウイルス（rBoDV-Cre）と通常dsRedタンパク質を発現しているが、Creリコンビナーゼの存在下でゲノムの組換えが起こり、GFPを発現するCreレポーター細胞を用いて、rBoDV-Cre持続感染細胞株を作成した。はじめにレポーター細胞株を作成した。ヒトオリゴデンドログリオーマ細胞（OL細胞）およびアフリカミドリザル腎臓由来Vero細胞に上記のレポーター遺伝子座を導入した。薬剤選択の後、さらにそれぞれの細胞をクローニングすることによってdsRedタンパク質の発現が高い細胞クローン（OL/CreRepおよびVero/CreRep）をそれぞれ3クローンずつ得た。またこれらのレポーター細胞にrBoDV-Creを感染させることによってレポーター遺伝子の発現がdsRedからGFPへと切り替わることを確認した。得られたそれぞれのレポーター細胞の中から1クローンずつを選び、rBoDV-Creを感染させた。感染後、感染細胞だけでなく非感染レポーター細胞も並行して継代し、同じ条件下で継代を行ったrBoDV-Cre感染および非感染細胞を得た。Vero/CreRep細胞ではウイルス感染率がほぼ100%に達したのに対し、OL/CreRep細胞では3ヶ月の継代で感染率が60%程度であった。OL/CreRep感染細胞に関しては現在も引き続き継代を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ウイルスや細胞などのツールの準備は順調に進んでいる。Vero細胞では計画通りに進んでおり、概ね順調に進展している。一方でOL細胞では想定していたよりもやや感染率の上昇が遅く、計画と比べてやや遅れ気味である。しかし、感染率は徐々に上昇しているため、数ヶ月の継代を続けることで100%持続感染細胞が得られると考えている。また今後行う予定のRNA-seqについて、既にライブラリ作成の条件検討は終了しており、解析パイプラインについても構築済である。
Strategy for Future Research Activity	今後抗ボルナウイルス薬として報告されているファビピラビルを用いて、作成したrBoDV-Cre感染レポーター細胞からウイルスの感染を排除する。こちらもウイルス感染細胞の作成時と同様にコントロール細胞を同時に継代する。ウイルス感染の排除を確認したらRNA-seqを行い、非感染細胞、ウイルス感染細胞、およびウイルス感染後にウイルスを排除した細胞の3つの細胞における宿主遺伝子の発現解析を行う。一方、学会において非分裂細胞の方が解析に適しているのではないかという指摘をいただいた。神経細胞は非分裂細胞であり、ボルナ病ウイルスの標的細胞の1つであるため、現在フランスの研究者と共同研究に関する打ち合わせを行っている。
Causes of Carryover	本研究において、100%感染細胞が得られた際にはファビピラビルという薬剤を使用予定である。しかし、rBoDV-Cre感染OL/CreRep細胞の樹立が少し遅れており、3月中旬に予定していた薬剤の購入を見送ったため。